自交不亲和性相关基因在芸薹属中的研究

谢立人，陈翠萍 ，李开祥，杜德志

(青海大学农林科学院，青藏高原种质资源研究与利用实验室，国家油菜改良青海分中心，青海省春油菜遗传改良重点实验室，西宁 810016)

自交不亲和性是指雌雄蕊发育正常的有花植物，在识别本身的花粉或特定基因型的花粉后不能正常授粉或结实的一种现象。这是植物在长期进化过程中形成的一种避免自交与近亲繁殖，有利于异交保持生物遗传多样性、环境适应性的保护机制。依据花器官的结构，可以将自交不亲和性分成同型性自交不亲和与异型性自交不亲和，异型性自交不亲和的植物可以通过花器官区分其亲和性，而同型性自交不亲和的植物却不可以[1]。基于自交不亲和性的遗传机理，该特性又可分为两种，分别为配子体自交不亲和(GSI)和孢子体自交不亲和(SSI)，而芸薹属植物属于孢子体不亲和，它的自交不亲和性是由S位点的复等位基因控制，S位点具有很高的多态性[2]。前人研究表明，大多数植物自交不亲和性是由一个S位点复等位基因位点控制，少数植物的自交不亲和性是由两个或多个S位点控制(如属于配子体自交不亲和的禾本科植物S-Z位点)[3]。目前关于旋花科、菊科、十字花科孢子体自交不亲和的研究有很多报道[4-5]，本文总结了十字花科芸薹属自交不亲和性相关基因的研究进展，以期为自交不亲和性状的研究和应用提供参考。

自交不亲和反应的发生是一个复杂且精密的过程，在开花植物中，花粉与柱头乳突接触后，在其中间形成“花粉足”，并经历吸附、水合、萌发、花粉管伸长等过程，任何一个过程不能正常进行都会导致自交不亲和。而柱头又可以被分为干性柱头与湿性柱头，十字花科植物的柱头属于干性柱头，干柱头在接受花粉方面有更严格的调节，因为花粉必须克服阻止病原体感染的表面屏障，以便允许亲和花粉管穿透，在孢子体自交不亲和发生时，大量的胼胝质在花粉管顶端积累，阻止花粉管的伸长导致授粉失败[6]。当成熟的不亲和花粉与柱头接触时，SRK与SCR识别产生互作，之后与MLPK、ARC1、Exo70A1、GLO1等基因发生一系列的识别，对花粉的水合萌发进行影响，导致自交不亲和的发生。

1.1 雌蕊决定因子SRK的研究

S位点受体激酶SRK(S-locus receptor kinase)作为雌蕊自交不亲和的决定因子，它的发现晚于S位点糖蛋白SLG(S-locus glycoprotein)，而在此之前，SLG被认为是雌蕊决定因子。S位点糖蛋白SLG最初被Nishio等[7]在1978年从白菜中分离出来。前人研究发现SLG蛋白被一个疏水性的信号残基分泌到成熟的柱头乳突细胞的细胞壁和胞间区，与自交不亲和反应发生的时间和部位相吻合，所以其最初被认为是芸薹属雌蕊的决定因子[8-10]。然而在一些表现自交不亲和的甘蓝和白菜中，发现其SLG基因发生了功能突变或丢失[11-12]，在Kusaba等[13]和Goubet等[14]对SI的琴叶拟南芥(A.lyrate)研究中，甚至没有发现SLG的存在，1990年Walker等[15]在玉米中发现一个受体激酶基因ZMPK1与芸薹属中的SLG有很高的相似性，1991年Stein等[16]在甘蓝中通过对基因组文库进行筛选，克隆得到一个在S位点上与SLG连锁的S位点受体激酶SRK，该基因与S位点连锁，并且在柱头中特异表达，Watanabe等[17]研究认为，SLG编码的蛋白与SRK编码的S受体结构域具有高度同源性，随后的研究者在白菜、甘蓝与甘蓝型油菜中克隆了多个位于S位点的SRK等位基因。SRK编码的蛋白由S受体区域、跨膜结构域和胞内具有磷酸化蛋白功能的激酶结构域三部分组成[16-19]。Takasaki等[20]的研究通过一系列转基因等实验，验证了SRK是芸薹属雌蕊的决定基因，该实验用SRK28和SLG28基因转入白菜，发现转入SRK28基因就可以使自交亲和SC的白菜成为自交不亲和SI，SLG在自交不亲和反应可能只起辅助作用，SRK编码一个跨越乳突细胞质膜的丝氨酸/苏氨酸受体激酶，是柱头自交不亲和表现的唯一决定因子。这些研究说明自交不亲和反应或许不一定需要SLG的参与，而SRK是雌蕊的决定因子，对花粉识别有重要的作用。

1.2 花粉决定因子SCR的研究

芸薹属自交不亲和性反应花粉识别因子为SP11(S-locus protein 11)/SCR(S-locus cysteine-rich protein)，SCR编码产物为富含半胱氨酸蛋白的分泌型小肽，该蛋白在花药绒毡层细胞中特异表达，SCR基因是自交不亲和反应中的特异基因，SP11/SCR是一对等位基因[21]。对花粉被蛋白PCPs的研究促使了花粉决定因子的发现，Stanchev等[22]和Doughty等[23]的研究认为，花粉被蛋白的产物是一个类似蛋白大家庭的成员，可以特异性地结合到SLG上。Stephenson等[24]的研究认为，自交不亲和性的雄性决定因子是一种蛋白，可能是PCP-A蛋白家族的成员。1999年Schopfer和Suzuk的实验都证实了SP11/SCR是花粉决定基因[25-26]。Franklin-Tong等[27]对自交亲和的甘蓝突变体的实验中，没有检测到SCR的存在。SCR与SRK作为配体与受体在花粉与柱头间形成的复合物，在自花花粉识别中起重要的作用[28]，相同S单倍型的SRK与SCR互相作用产生复合物是自交不亲和反应通路上的第一步。也有研究者认为表观遗传效应参与了不同S单倍型的显隐性关系，DNA甲基化导致SP11等位基因的隐性沉默，使之出现了单等位基因表达的现象[29]。之后的研究人员在拟南芥中的研究认为SRK胞外域有几个糖基化位点，而SRK的激活并不依赖于这些聚糖，表明SP11/SCR结合是在氨基酸水平上指定的[30]。而芸薹属SI反应信号通路是一个复杂的细胞间信号传导过程，其自交不亲和性的作用机制还有待进一步研究。

1.3 SI信号通路中相关基因的研究

除了S位点之外还有许多其他基因参与自交不亲和反应，包括MLPK(M位点蛋白激酶)、ARC1(臂展重复蛋白)、THL1/2(类硫氧还蛋白h)、Exo70A1(胞吐复合物)、GLO1(乙二醛酶)等基因。这些基因在SCR与SRK识别后起作用，形成一个信号通路，最终导致自交不亲和性。对白菜型油菜Yellow Sarson突变体的研究发现了M位点蛋白激酶(MLPK)，M位点和S位点是互相独立的，质膜定位表明它可能在SRK附近发挥作用，磷酸化的SRK和MLPK(M位点蛋白激酶)之后再与ARC 1相互作用，MLPK对自交不亲和起正调控作用[31-32]。MLPK有两种不同的转录本，MLPKf1和MLPKf2，它们是通过不同的转录起始位点产生的，编码两种仅在N端不同的亚型，两者翻译的蛋白都在乳突细胞膜上，并且MLPK能与SRK直接互作[33]。Chen F等[34]利用RNA沉默与CRISPR/Cas 9技术对甘蓝型油菜MLPK基因进行研究，自交不亲和反应在RNA沉默后部分被抑制，在自交不亲和系“S-70”中敲除MLPK后的SI油菜完全变为自交亲和植株。这些研究表明，MLPK是SI信号通路上与SRK相互作用的重要因子。前人通过筛选与S-位点受体激酶(SRK)结构域相互作用的酵母双杂交蛋白库，分离出一种名为ARC 1的蛋白，RNA印迹分析显示，ARC1的表达局限于自交不亲和反应的柱头部位，是油菜柱头特异表达的基因[35]。研究者认为ARC1是SRK的下游效应物，实验证实上调ARC1基因表达可以使自交不亲和植株的结籽减少，下调ARC1基因表达的植株发生自交部分结籽，因此与MLPK相似的是ARC1也属于自交不亲和反应的正调控基因[36]。之后的研究表明ARC1拥有一个U-box结构，具有E3泛素连接酶活性，泛素化蛋白水平在不亲和授粉时提高，而ARC1促进雌蕊亲和性因子的泛素化，降解亲和反应的蛋白，进而导致自交不亲和的发生[37]。另外，前人对自交不亲和琴叶拟南芥(Arabidopsis lyrata)的转基因实验证明ARC1可能是自交不亲和反应所必须的基因[38-39]。类硫氧还蛋白(THL 1/2)是Bower等通过酵母双杂的方法筛选到的，当柱头未授粉时，SRK被类硫氧还蛋白抑制，SRK的磷酸化受到阻碍,所以类硫氧还蛋白可能是SRK磷酸化的抑制剂,是自交不亲和的负调控因子[40-41]。前人在筛选与ARC1相互作用的蛋白时，发现了甘蓝型油菜Exo70A1基因，当在自交不亲和油菜“W 1”的柱头中Exo70A1过表达可以部分克服自交不亲和，抑制Exo70A1表达时表现出柱头上花粉无法萌发[42]，在植物中，ARC1抑制Exo70A1，来阻断基底花粉识别途径，从而阻止乳头质膜上的囊泡/MVB分泌，发生SI反应[43]。因此Exo70A1也可能是自交亲和反应的重要因子。Sankaranarayanan等[44]的研究表明，GLO 1是授粉所需的柱头亲和因子，自交不亲和的甘蓝型油菜柱头过表达GLO1会导致自交不亲和反应的部分破坏，导致不亲和授粉部分结籽。自花授粉后，ARC 1介导GLO 1泛素化降解含量降低，导致丙酮醛(MG)水平的增加，MG具有细胞毒素，破坏柱头乳突细胞导致自交不亲和的发生。因此GLO1基因是自交亲和的重要因子。根据前人的研究状况，我们可以发现自交不亲和反应信号通路是一个复杂的过程。当柱头未授粉时，SRK被类硫氧还蛋白抑制，而自花授粉时(图1)，S单倍型相同或属于种间同源对的花粉配体(SCR)与柱头中的受体(SRK)相互作用并通过自体磷酸化作用激活SRK，磷酸化的SRK与质膜定位的MLPK相互作用，共同磷酸化激活E 3泛素连接酶ARC 1，因此MLPK和ARC 1起着正调控的作用，而GLO 1与Exo 70 A 1起负调控的作用，激活的ARC 1泛素化降解亲和反应关键蛋白GLO 1和Exo 70 A 1，导致MG的增加，细胞内引起自噬的激活，从而影响花粉的正常水合萌发，最终引起自交不亲和反应。

图1 孢子体自交不亲和反应通路

柱头未授粉时，SRK被THL1/2抑制，而识别到自花花粉时，SCR与SRK相互作用并通过自体磷酸化作用激活SRK，之后磷酸化的SRK与MLPK相互作用，共同磷酸化激活E 3泛素连接酶ARC 1，激活的ARC 1泛素化降解亲和反应关键蛋白GLO 1和Exo 70 A 1，导致MG的增加，引起自噬的激活，从而影响花粉的正常水合萌发。

随着SLG、SRK、SP11/SCR基因被克隆与序列的比对，研究者发现不同的SP11/SCR和SRK等位基因共同进化成一系列S单倍型，编码相应的配体-受体对，这些组合以一个整体向子代传递，几乎不发生重组，这些组合被分为不同的S单倍型[45]。当两种相同S单倍型花粉与柱头结合时发生不亲和反应，不同S单倍型自交不亲和花粉与柱头组合时，则能发生异交[46]。也有例外，在甘蓝与白菜的研究中也发现，一些相同的S单倍型之间可以互相识别(如BrS-60与BoS-15)，这些S单倍型被称作种间同源对[47]。根据SLG与SRK序列的相似性，S单倍型被分为Ⅰ类和Ⅱ类，遗传分析表明，Ⅰ类S单倍型相对于Ⅱ类S单倍型属于显性，并且Ⅰ类S单倍型的自交不亲和性更强[48]。对白菜不同单倍型研究表明，这种S单倍型的显隐性关系在柱头与花粉之间是互相独立的，花粉端(SCR)之间一般表现出显隐性，而柱头中(SRK)之间通常是共显性的[49]。Kakizaki等[50]选取4个白菜型油菜Ⅱ类S单倍型的(6种组合)杂合型与其亲本纯合型进行授粉实验，在其花粉侧发现线性显隐性关系，确定Ⅱ类S单倍型的显隐性关系为BrS44>BrS60>BrS40>BrS29。Shiba等[51]通过对白菜Ⅰ类S单倍型(S52)与Ⅱ类S单倍型(S60)进行研究，发现在S52与S60的杂合材料中，来自S60的SCR基因表达量明显降低，Fujimoto[52]的研究表明，在Ⅰ类/Ⅱ类杂合株中，Ⅰ类与SCR基因无功能时，Ⅱ类SCR也不表达，所以SCR的显隐性关系是转录水平调控的。sRNA和miRNA广泛参与细胞内基因表达调控，在白菜Ⅰ类单倍型SLG上游5 kb左右发现存在一段与SCR启动子区被甲基化的序列高度同源的序列，命名为SP 11-methylation-inducer region(SMI)，这段序列可以产生一个24-nt的小RNA，Tarutani等[53]原位杂交实验表明，隐性SP11等位基因的启动子区域在花药绒毡层中特异性甲基化，SMI诱导Ⅱ类SCR启动子区域发生高度的DNA甲基化，这种甲基化使Ⅱ类SCR基因沉默，SMI的发现很好地解释了Ⅰ类、Ⅱ类S单倍型间显隐性的分子机理。最近Yasuda等[54]的研究发现，在Ⅱ类S单倍型SRK基因下游(5～10 kb)存在另一个产生小RNA的位点SMI2，对4个线性显隐性关系做出解释，在转基因实验中研究者将白菜BrS60单倍型的SMI 2分别转入BrS40、BrS29和BrS44纯合单倍型植株中，BrS40和BrS29转基因材料表现自交亲和表型，SCR基因均没有表达，而在BrS44转基因植株仍表现自交不亲和的表型，说明BrS60单倍型的SMI 2可以抑制隐性单倍型BrS40和BrS29的SCR基因的表达。这个模型的提出为自交不亲和反映显隐性研究提供了重要的基础。

自交不亲和性作为保持生物遗传多样性、环境适应性的重要机制引起了许多学者的关注与研究，对芸薹属孢子体自交不亲和的广泛研究已经在较大程度上揭示了导致自交不亲和发生的信号通路(如图1)。在SI反应信号通路中，除了S位点的基因，还有一些非S位点的因子与S位点基因互作，具有极其复杂的机制，挖掘其他参与SC与SI重要因子与它们的功能分析是值得深入探究的问题。研究者在拟南芥中发现表观遗传效应在自交不亲和反应中具有重要作用，目前DNA甲基化相关的基因是否参与芸薹属植物自交不亲和反应还未见报道，进一步对DNA甲基化在芸薹属SI中的作用研究具有重要的意义。在生产应用方面，可以利用杂种优势中的自交不亲和途径选育优良的农作物品种，而自交不亲和性的分子机制研究为分子育种工作提供极其重要的理论支撑。