猪伪狂犬病病毒糖蛋白gD在谷氨酸棒杆菌中的表达及优化

惠萌萌， 孙曼曼， 刘秀霞,2,3， 杨艳坤,2,3， 白仲虎,2,3

(1.江南大学粮食发酵与食品生物制造国家工程研究中心，江苏无锡214122；
2.江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡214122；
3.江苏省生物活性制品加工工程技术研究中心，江苏无锡214122)

伪狂犬病(Pseudorabies，PR)是一种由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的传染性、病毒性疾病，宿主范围广，可引起多种家畜、家禽以及野生动物共患，属α疱疹病毒亚科[1]。PRV在猪群中呈暴发性流行，临床症状包括猪的生长迟缓和呼吸困难、母猪流产和种猪不孕，大都呈致死性感染，对全世界养猪业危害极大[2-3]。自1914年以来，基于临床症状、动物接触史或血清抗体检测结果，偶有关于人类感染PRV的争议性报道[4-5]。2019年，Wang等[6]报道了4例人急性脑炎病例，均由伪狂犬病病毒感染引起，首次提供了PRV向人群跨种传播的病毒分离证据。研究结果表明，PRV基因组由线性双股DNA组成，大约长150 kb，具独特长区段(UL)和短区段(US)，位于UL区的主要编码蛋白质有gB、gC、gH、TK等，位于US区的主要编码蛋白质有gD、gE、gG、gI和gL等。gC、TK和gE是PRV主要毒力蛋白质，gB、gD和gH是病毒复制的必需蛋白质[7]。目前已发现的11种PRV糖蛋白中，gB、gC、gD均能诱导机体产生中和抗体，其单克隆抗体在体内、体外均能中和PRV，是制造亚单位疫苗的首选蛋白质。gD，又称gp50，开放阅读框由1 206个碱基组成，蛋白质相对分子质量约为4.5×104，是成熟PRV表面的主要囊膜糖蛋白，参与病毒的穿透过程；
gD作为必需的结构蛋白质，在PRV侵入宿主细胞时的感染和增殖过程中具有重要作用[8]。研究结果表明，不同毒株间gD的DNA水平和蛋白质水平的同源性都非常高，说明gD在遗传过程中是高度保守的。

基因工程亚单位疫苗是指将病原的保护性抗原编码基因在原核或真核细胞中表达，再将基因产物制成疫苗，其优点是：安全性高，接种后不会引起机体急性感染；
稳定性好，便于输送和贮存；
可与野毒感染产生的免疫应答区分，利于疫病的控制与根除[9-11]。Marchioli等[12]筛选出一株表达gD的细胞株，免疫猪后能产生中和性抗体并抵抗PRV的强毒攻击。作为PRV最重要的保护性抗原，gD在刺激动物机体后，可以产生中和抗体[13]，是PRV亚单位疫苗的主要候选蛋白质，在PRV的免疫防控中意义重大[14-15]。为进一步加强对PR的疫情监测和流行病学调查，gD还可作为理想的血清学检测用抗原。

谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)是一种典型高GC含量的革兰氏阳性菌[16]，被美国食品药品监督管理局(FDA)认证为安全菌株(Generally recognized as safe，GRAS)，具有无内毒素、胞外蛋白酶含量少[17]、可高密度发酵且易于分泌[18-21]等优良特性，是目前工业生产重组蛋白质的优越表达系统[22-23]。

PRV蛋白的表达有一定的难度，构建的表达载体往往不能表达，其主要原因可能是PRV蛋白与工程菌的兼容性不好，现有的研究多用病毒或真核载体表达，在大肠杆菌中以包涵体形式表达[24-25]，尚未有在谷氨酸棒杆菌中表达生产gD的研究报道。本研究拟在谷氨酸棒杆菌中进行gD的可溶性表达，通过Western Blot和酶联免疫吸附剂测定(ELISA)法检测gD蛋白的表达和抗原活性，并优化发酵条件以提高产量，为进一步研制PRV亚单位疫苗提供一种可用的表达体系，也为PRV免疫学检测方法提供理论和技术支撑。

1.1 材料

1.1.1 菌株 本研究所用的菌株见表1。大肠杆菌用于构建质粒，谷氨酸棒杆菌用于表达重组蛋白质，均由本实验室保存。

1.1.2 质粒 本研究所用的质粒见表2。质粒pXMJ19用作谷氨酸棒杆菌外源蛋白质表达载体，由本实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 培养条件 大肠杆菌培养条件：LB培养基(蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，蒸馏水定容)，37 ℃，220 r/min。谷氨酸棒杆菌培养条件：LBB培养基(蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，脑心浸出液10 g/L，蒸馏水定容)，30 ℃，220 r/min。大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌培养体系中使用的氯霉素质量浓度分别为30 μg/ml和20 μg/ml。

1.2.2gD表达质粒的构建 从美国国家生物技术信息中心(NCBI)官网上获取gD的氨基酸序列(GenBank：ABR13825.1)，对其编码序列进行密码子优化(参考CorynebacteriumglutamicumATCC13032)。基因合成由苏州安升达生物科技有限公司完成，添加5′(Hind Ⅲ)和3′(EcoR Ⅰ)。将基因通过5′(Hind Ⅲ)和3′(EcoR Ⅰ)酶切连接克隆至表达载体pXMJ19，获得重组基因表达质粒pXMJ19-gD。

1.2.3 gD表达菌株的构建 将构建好的质粒pXMJ19-gD电击转化C.glutamicum获得表达菌株Cg-gD，30 ℃培养36 h，对长出的单菌落进行PCR和测序验证。为更好地反映gD的表达情况，同时构建Cg-pXMJ19作为空白对照。

表1 本研究所用菌株

表2 本研究所用质粒

1.2.4gD的诱导表达 Cg-gD和Cg-pXMJ19分别接种于10 ml氯霉素抗性LBB培养基中，在30 ℃、220 r/min条件下过夜培养，之后以2%接种量转接到50 ml新鲜的氯霉素抗性LBB培养基中，培养3～5 h(OD600=0.6～0.8)时添加1‰(质量体积比)异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导(100 mmol/L IPTG)，继续培养24 h后收集菌体进行蛋白质分析。

1.2.5 生长曲线的测定 将蛋白质表达菌株接种于10 ml氯霉素抗性LBB培养基中，30 ℃、220 r/min条件下过夜培养，转接至100 ml新鲜的LBB培养基中，使初始OD600=0.2。30 ℃、220 r/min条件下培养48 h，每4 h取1次样并测定OD600。

1.2.6 蛋白质表达鉴定 取gD发酵产物(定量OD600=10)在12 000 r/min离心，弃上清液，用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗菌体2次，并用PBS重悬菌体，破碎，取全菌液、上清液和沉淀(用PBS重悬)制成相应蛋白质样品，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western Blot分析。使用组氨酸(His)单抗进行Western Blot定性分析。纯化后使用ELISA法进行蛋白质检测，封闭液用5%牛血清白蛋白(BSA)，一抗用gD阳性血清，二抗用辣根过氧化物羊抗猪IgG。ELISA方法：将纯化液按一定梯度进行稀释后，每孔100 μl，37 ℃、1 h孵育至酶标板上，用洗液清洗5次后甩干；
按1∶800的体积比每孔100 μl继续孵育一抗试剂，37 ℃，1 h，用洗液清洗5次后甩干；
按1∶2 000的体积比每孔加入100 μl继续孵育二抗试剂，37 ℃，1 h，用洗液清洗5次后甩干；
每孔加入200 μl显色液，37 ℃，1 h；
最后每孔加入50 μl终止液，观察颜色反应或检测OD450值。

1.2.7 蛋白质纯化及定量分析 取50 ml发酵液，收集菌体沉淀，用50 ml结合液(Binding buffer)重悬，并进行高压匀浆破碎，于12 000 r/min、4 ℃离心30 min，收集上清液，用镍离子亲和层析柱进行目标蛋白质的纯化，用不同浓度洗脱液(Elution buffer)梯度洗脱目标蛋白质。结合液：Na2HPO4·12 H2O 5.8 g/L，NaH2PO4·2H2O 0.593 g/L，NaCl 29.22 g/L，用蒸馏水定容；
洗脱液：Na2HPO4·12H2O 5.8 g/L，NaH2PO4·2H2O 0.593 g/L，NaCl 29.22 g/L，咪唑34 g/L，用蒸馏水定容。使用BCA试剂盒法进行蛋白质定量分析。

2.1 表达gD的菌株构建与验证

为获得表达gD的谷氨酸棒杆菌，首先构建质粒pXMJ19-gD，质粒图谱如图1a所示，载体质粒pXMJ19酶切结果如图1b所示。为观察谷氨酸棒杆菌表达gD对菌株生长的影响，对Cg-gD和Cg-pXMJ19进行了生长曲线测定，结果显示，表达gD的菌株前期生长稍显缓慢，对菌株生长的影响较小(图1c)。Cg-gD发酵24 h后，取样进行蛋白质表达分析，Western Blot分析结果如图1d所示，在相对分子质量4.5×104处有明显条带，与gD理论大小相符，且基本为可溶性表达，但在1.7×104处有降解，SDS-PAGE条带较浅，表明表达量较低。

a：pXMJ19-gD的质粒图谱；
b：pXMJ19载体酶切结果，M为10 000 marker，L1～L3为生物学平行样本；
c：Cg-pXMJ19和Cg-gD 菌株48 h生长曲线；
d：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western Blot分析结果，M为蛋白质marker，1～3分别为Cg-pXMJ19发酵全菌、破碎后上清液、沉淀，4～6分别为Cg-gD发酵全菌、破碎后上清液、沉淀。图1 质粒pXMJ19-gD的构建与目的蛋白质分析Fig.1 Construction of plasmid pXMJ19-gD and analysis of target protein

2.2 gD表达元件优化

为进一步提高gD的表达量，对表达元件启动子和信号肽进行了优化。由于C.glutamicum中组成型启动子更有利于外源蛋白质的表达[26]，因此分别选用组成型H36启动子(图2a)、cspB和0949信号肽对gD的表达进行优化(图3a)。

为构建组成型表达质粒H36-gD，对pXMJ19-gD质粒进行Hind Ⅲ和EcoR Ⅴ酶切，凝胶回收后获得含目的基因的载体，H36序列(300 bp)使用引物H36-F+H36-R扩增获得，载体和片段以1∶3浓度比例进行同源重组，转化E.coliJM109并测序验证。用相同方法构建对照质粒H36-pXMJ19。将菌落PCR和测序正确的H36-gD电转入C.glutamicum进行发酵表达。SDS-PAGE和Western Blot分析结果如图2所示，可见组成型质粒H36-gD的蛋白质表达条带颜色深，灰度分析结果显示，其蛋白质表达量比诱导型质粒pXMJ19-gD的蛋白质表达量高4.5倍。

a：H36-gD构建示意；
b：Cg-H36-gD菌株PCR验证，M为2000 marker，1～6平行样品；
c：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western Blot分析结果，M为蛋白质marker，1为Cg-pXMJ19破碎后上清液，2为Cg-gD破碎后上清液，3为Cg-H36-gD破碎后上清液。图2 组成型表达质粒H36-gD的构建与目的蛋白质分析Fig.2 Construction of constitutive expression plasmid H36-gD and analysis of target protein

为了研究分泌表达对gD表达量的影响，分别增加cspB和0949 2种信号肽构建分泌型表达质粒cspB-gD和0949-gD。以pXMJ19-gD质粒为模板，使用引物cspB-F+sp-R、cspB-R+sp-F扩增片段，凝胶回收后两片段以1∶1浓度比例进行同源重组，转化E.coliJM109并测序验证，获得cspB-gD。cspB-pXMJ19的构建模板为pXMJ19。以pXMJ19-gD质粒为模板，使用引物gD-F+ gD-R扩增载体，0949-F+0949-R直接引物退火，延伸获得片段，载体和片段以1∶3浓度比例进行同源重组，转化JM109并测序验证，获得0949-gD。0949-pXMJ19的构建模板为pXMJ19。长出的转化子通过菌落PCR和测序来验证，用测序正确的质粒转化C.glutamicum进行发酵诱导表达。SDS-PAGE和Western Blot结果(图3)显示，在相对分子质量4.5×104处无条带，这表明增加信号肽序列，gD在谷氨酸棒杆菌中反而不表达，猜测是因为蛋白质自身特性，在添加信号肽后不能正确折叠导致无法表达。

a：质粒cspB-gD和0949-gD构建示意；
b：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western Blot分析结果，M为蛋白质marker，1～3分别为Cg-pXMJ19发酵液上清液、全菌、细胞破碎后上清液，4～7分别为Cg-cspB-gD发酵液上清液、全菌、细胞破碎后上清液、细胞破碎后沉淀，8～11分别为Cg-0949-gD发酵液上清液、全菌、细胞破碎后上清液、细胞破碎后沉淀。图3 糖蛋白gD分泌系统的构建与目的蛋白质分析Fig.3 Construction of glycoprotein gD secretion system and analysis of target protein

2.3 gD的表达底盘菌株优化

为了分析不同底盘菌株对gD表达的影响，以提高蛋白质表达量，在前期研究基础上，选取3株底盘菌株(分别为C.glutamicumCGMCC1.15647、蛋白酶敲除菌株Cg-△clpC和Cg-△clpS)进行研究。首先进行生长曲线的测定，结果如图4a所示，与对照菌株Cg-pXMJ19相比，表达gD的其他菌株生长都受到不同程度的影响，△clpC -H36-gD长势最弱。SDS-PAGE和Western Blot分析结果(图4b)显示，Cg-△clpS-gD的蛋白质表达条带最深，经灰度分析发现其蛋白质表达量比组成型表达菌株Cg-H36-gD高2.4倍。由此可见clpS蛋白酶对外源蛋白质在C.glutamicum中表达的影响最大。

a：不同底盘菌株的36 h生长曲线；
b：Western Blot分析结果，M为蛋白质marker，1～6均为发酵后破碎上清液，1为Cg-pXMJ19，2为Cg-H36-gD，3为Cg-△clpS-gD，4为Cg-△clpC-gD，5为Cg-△clpS-H36-gD，6为Cg-△clpC-H36-gD。图4 gD的表达底盘菌株优化Fig.4 Optimization of chasis strain expressing gD

2.4 gD的表达发酵条件优化

选取最优表达菌株Cg-△clpS-gD进行发酵条件优化，以进一步提高gD的表达量，分别从发酵温度和诱导时间进行优化。根据谷氨酸棒杆菌生长特性，选取16 ℃、23 ℃、30 ℃ 3个温度进行gD的表达，以Cg-△clpS-pXMJ19作为阴性对照，摇瓶培养24 h后进行SDS-PAGE和Western Blot分析。结果(图5a)显示，30 ℃培养条件下，蛋白质条带最深，16 ℃和23 ℃条件下蛋白质条带较浅，且菌株长势弱于30 ℃培养条件。这表明对于gD的表达而言，30 ℃不仅有利于菌株生长，还有利于蛋白质的表达。为探究诱导时长对gD表达的影响，分别在诱导后6 h、12 h、18 h、24 h、30 h、36 h取样进行目的蛋白质表达量分析。结果(图5b)显示，gD在诱导后24 h才开始明显表达，且后期增量不明显，这表明菌株前期主要侧重于生长，在稳定期进行外源蛋白质表达。

a：不同温度发酵表达gD的SDS-PAGE(上图)和Western Blot分析结果(下图)，其中1为Cg-pXMJ19发酵后破碎上清液，2～4分别为16 ℃、23 ℃、30 ℃下Cg-△clpS-gD发酵后破碎上清液；
b：不同诱导时长发酵表达gD的SDS-PAGE(上图)和Western Blot分析结果(下图)，其中1为Cg-pXMJ19发酵后破碎上清液，2～7分别为Cg-△clpS-gD发酵后6 h、12 h、18 h、24 h、30 h、36 h破碎上清液；
M：蛋白质marker。图5 不同温度、诱导时长发酵表达gD的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western Blot 分析Fig.5 Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and Western Blot analysis of gD expression at different fermentation temperatures and induction durations

2.5 gD的纯化及定量分析

在目的蛋白质3′端添加6×His标签，使用镍离子亲和层析柱对其进行纯化分析，结果表明，使用5%洗脱液即可将目的蛋白质洗脱，纯化样品SDS-PAGE结果如图6a所示。使用BCA试剂盒对目的蛋白质进行定量分析，经计算，200 ml摇瓶发酵液中，菌株Cg-△clpS-gD发酵后gD质量浓度约为517 mg/L。洗脱液蛋白质电泳结果显示仍有少量杂蛋白质，且流穿液也含有目的蛋白质，说明目的蛋白质和纯化柱结合得不够紧密。使用ELISA法检测纯化后的gD，以5% BSA为封闭液，gD抗体阳性血清为一抗、HRP羊抗猪IgG为二抗进行包板试验，以2.1倍阴性对照值作为阳性结果的判断标准，OD450目的蛋白>2.1倍OD450阴性对照，纯化后gD呈阳性。以gD抗体阳性血清作单抗孵育，Western Blot结果(图6c)显示，gD有特异性条带。

a：△clpS-gD纯化后样品的SDS-PAGE分析结果，1为Cg-pXMJ19破碎后上清液，2为△clpS-gD纯化流穿液，3～4为纯化蛋白质样品；
b：BSA质量浓度标准曲线；
c：OD450值和Western Blot结果，CK为阴性对照，A1为纯化流穿液，A2为纯化蛋白质样品。图6 糖蛋白gD的定量定性检测Fig.6 Quantitative and qualitative detection of glycoprotein gD

谷氨酸棒杆菌在表达异源蛋白质上具有很大潜力，相较于大肠杆菌表达系统，C.glutamicum不含内毒素，更适合医药蛋白质生产；
与同为革兰氏阳性菌的枯草芽孢杆菌相比，C.glutamicum能正确折叠蛋白质，确保蛋白质活性；
与真核细胞相比，C.glutamicum生长周期短，培养成本不高，基因操作成熟，可高密度发酵，有利于异源蛋白质的发酵放大。本研究中，为了在谷氨酸棒杆菌中表达gD，首先进行pXMJ19-gD的构建与表达，初步通过SDS-PAGE和Western Blot条带分析，验证gD可在谷氨酸棒杆菌中可溶性表达。其次通过表达元件、底盘菌株、发酵条件等优化，发现与诱导型表达质粒相比，组成型表达质粒更有利于gD的表达，蛋白质表达量提高了4.5倍；
蛋白酶敲除菌株Cg-△clpS诱导表达gD的能力最强，蛋白质表达量是组成型的2.5倍。上述研究结果说明，不同菌株对于不同启动子的适配能力不同。根据谷氨酸棒杆菌的生长特性，30 ℃培养、诱导24 h是gD表达的最优条件。推测表达gD对宿主菌有一定毒性，所以使宿主菌生长缓慢，生长到一定程度后，延迟表达。最后，通过镍离子层析柱纯化目的蛋白质，经BCA试剂盒检测，在摇瓶水平200 ml发酵液中目的蛋白质质量浓度可达517 mg/L。利用ELISA法检测目的蛋白质，OD450值和显色反应均显示纯化后的gD呈阳性。综上所述，本研究成功构建了表达可溶性gD的谷氨酸棒杆菌系统，该系统同样可以用于其他异源蛋白质的表达，目前已有用C.glutamicum表达VHH和scFv等异源蛋白质的报道。

本研究中还存在一些需要进一步探索的问题，比如本研究只验证了蛋白酶单敲除菌株对gD表达的影响，组合敲除的情况有待进一步研究。其次，gD与镍离子亲和层析柱结合的紧密性也需要进一步研究，以获得更高纯度的目的蛋白质。最后，没有进行大规模发酵培养，优化更多的发酵条件，比如碳源、溶解氧含量等。这些未解决的问题同样具有重要意义，亟待研究人员进一步探索。