花椒叶提取物对大肠杆菌与金黄色葡萄球菌的抑制作用探究

晏娅蓉，高亚敏，廖 娟，周全惠，阴欢欢

（文山学院 三七医药学院，云南 文山 663000）

花椒（Zanthoxylum bungeanum Maxim.），其他名称还有大椒、檓和蜀椒等，主要化学成分有挥发油、酰胺和生物碱[1]。花椒是一种有价值的经济植物，我国资源丰富，是栽培、产量的第一大国[2]。把花椒作为一种中药材治疗疾病在我国很早就开始了[3]。研究人员大多都是对花椒籽粒、果皮成分进行探索[4-7]，而对花椒叶抑菌方面的研究和报道较少。

花椒种植中产量最大的副产物是花椒叶，花椒叶味辛、性热和无毒，化学成分主要有生物碱、木脂素、酰胺和黄酮等[4]。近年很多文献报道称，花椒叶中的黄酮具有降血脂、抗炎和抗病毒等作用[8]。而Chang 等[9]国外学者的研究报道证明花椒叶中的多酚物质具有保护神经细胞及抗氧化作用。吕可等[10]采用花椒叶浸提液对土壤微生物进行研究，结果显示花椒叶浸提液让根际的活性降低，对真菌根际活性减弱最多，细菌中等，放线菌最少。龚晋文等[11]对花椒叶提取物在不同条件下对3 种常见菌的抑菌作用进行研究，结论为花椒叶提取物对3 种常见菌有明显的抑菌效果。

引起食源性疾病的主要因素之一是食品中污染的病原细菌，在食物中常见的污染细菌是金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus）和大肠杆菌（Escherichia coli）[12]。在空气、土壤、水及食具中金黄色葡萄球菌大量分布，人和动物带菌率极高[13]。能引起骨髓炎、心内膜炎和坏死性筋膜炎等多种疾病[14]。我国每年的食物中毒事件大多由金黄色葡萄球菌引起[15]。最常见的病原细菌还有大肠杆菌，致病性是医学和兽医学中常见的[16]。

本研究以花椒叶作为实验材料，探究不同方法提取花椒叶提取物在不同pH、温度和浓度下对2 种常见菌的抑制作用，为花椒叶的科学研究和产品开发奠定基础。

1.1 材料

花椒叶在文山学院校园内花椒树上采摘，品种为秦椒，保鲜储存。大肠杆菌菌株ATCC25922（Escherichia coli）和金黄色葡萄球菌菌株ATCC6538（Staphylococcus aureus，S.aureus）于北京生物保藏中心购买。

实验器材包括：DHP-9052 恒温培养箱，厂家为上海—恒科学仪器有限公司；
Scout SE-SE602 F 天平，厂家为奥豪斯仪器有限公司；
N-126（D）显微镜，厂家为宁波永新光学股份有限公司；
LDZX-50L 高压蒸汽灭菌锅，厂家为上海申安医疗器械厂；
TS-200B 恒温摇床，厂家为上海天呈实验仪器制造有限公司；
TY-837打孔器，厂家为通用集团国际有限公司；
尼康数码相机D7500。

试剂包括：75%酒精，级别为分析纯，厂家为天津市风船化学试剂科技有限公司；
蒸馏水，文山学院三七医药学院实验室提供；
LB 培养基（1 000 mL 蒸馏水），文山学院三七医药学院实验室提供；
10 g 胰蛋白胨，级别为生物试剂，厂家为北京奥博星生物技术有限责任公司；
5 g酵母提取物，级别为实验试剂，厂家为天津市风船化学试剂科技有限公司；
10 g NaCl，级别为分析纯，厂家为天津市风船化学试剂科技有限公司；
5 mol/L NaOH（氢氧化钠），级别为分析纯，厂家为天津市风船化学试剂科技有限公司；
7 g 琼脂，级别为生物试剂，厂家为北京奥博星生物技术有限责任公司。

1.2 实验方法

1.2.1 花椒叶提取物的制备

采摘新鲜花椒叶后研磨捣碎，采用过滤法、萃取法和蒸馏索式提取法制备花椒叶提取物。

1.2.2 培养基的制备

LB 培养基：根据实验需要计算所需药品量，分别称量，先将琼脂加入蒸馏水加热完全溶解，再根据培养基的成分在适量蒸馏水中加入酵母提取物、胰蛋白胨和NaCl，与已经溶解的琼脂混匀。用5 mol/L 的氢氧化钠调节其pH 至7.0，用蒸馏水定容至目标体积，定容后分装，将适量培养基分别装入250 mL 锥形瓶中，用棉塞和牛皮纸封装，在101.2 kPa 的高压下蒸汽灭菌30 min，培养皿亦进行高压蒸汽灭菌处理。

1.2.3 活化菌种与制备菌悬液

活化大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，检查是否有杂菌污染，在超净工作台中涂布，在培养基中进行培养，培养3 代，选取菌种活力最佳的菌，将活化的供试菌制备成菌悬液。

1.2.4 制备滤纸片与菌液涂布

使用打孔器打出圆形滤纸片，进行灭菌，将滤纸片浸于花椒叶提取物中备用，接着进行菌液涂布，将菌液加到培养基中，用涂布棒涂布均匀，置于恒温箱一段时间后取出备用。

1.2.5 抑菌实验

在超净工作台上，先用不同方法制备的花椒叶提取物进行抑菌实验，把培养皿放入恒温培养箱培养观察，查看抑菌圈的大小并测量其直径，分别用抑制作用最好的方法获得花椒叶提取物，在不同条件（温度、浓度和pH）下观察花椒叶提取物对2 种菌的抑制作用。

2.1 不同方法获得的花椒叶提取物对2 种菌的抑制作用

由表1 可知，不同方法提取花椒叶，蒸馏索式提取法得到的花椒叶提取物对金黄色葡萄球菌抑制作用最强，其次是过滤法，最后是萃取法。萃取法得到的花椒叶提取物对大肠杆菌抑制作用最好，其次是蒸馏索式提取法，最后是过滤法。用不同方法提取的花椒叶对2 种菌的抑制作用不同，初步分析可能是菌种的类别差异所致，金黄色葡萄球菌是革兰氏阳性菌，大肠杆菌是革兰氏阴性菌，2 者的形态、构造和生长所需的营养条件不同，使得2 种菌对不同方法获得的花椒提取物抑菌成分呈现明显差别[17]。

表1 不同方法获得的花椒叶提取物对2 种菌的抑制作用

2.2 花椒叶提取物在不同浓度下对2 种菌的抑制作用

由表2 可知，当花椒叶提取物浓度（浓度用体积百分比表示）为0%时，对2 种菌基本无抑制效果，当花椒叶提取物浓度为50%时，对2 种菌均有较为明显的抑制效果，当花椒叶提取物浓度为100%时，对2 种菌抑制作用最佳。随着花椒提取物浓度的提升对2 种菌的抑制作用也随之增强，可能原因是随着花椒提取物浓度增加，起抑制作用的有效成分随之增加，在其他条件一致，花椒提取物浓度增加的过程中，2 种菌的抑菌圈呈现逐渐增大的趋势。此外，在花椒提取物浓度相同的条件下，对2 种菌的抑制程度出现细小差异，可能原因是革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌在菌体结构、营养方式等方面的不同，引起其对抑菌有效成分反应不同[17]。

表2 花椒叶提取物在不同浓度下对2 种菌的抑制作用

2.3 花椒叶提取物在不同pH 下对2 种菌的抑制作用

由表3 可知，当pH 为7 或大于7 时，花椒叶提取物对2 种菌的抑制作用明显，当pH 小于7 时，花椒叶提取物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌基本无抑制作用，且对2 种菌的抑制作用差异不显著。可能原因是pH 对培养基中营养物质的离子化程度起作用，进一步导致菌体对营养物质的吸收，代谢反应中酶的活性不同，从而使得2 种菌在不同pH 条件下对花椒叶提取物抑菌成分敏感程度呈现差异[17]。

表3 花椒叶提取物在不同pH 下对2 种菌的抑制作用

2.4 花椒叶提取物在不同温度下对2 种菌的抑制作用

由表4 可知，温度为20 ℃时，花椒叶提取物对2种菌的抑制作用明显，温度为15 ℃和25 ℃时，花椒叶提取物对2 种菌的抑制作用较明显，且在3 个温度下对2 种菌的抑制作用差别不显著。初步分析导致不同的温度对2 种菌的抑制作用不同，可能原因是不同的温度下菌体的蛋白酶活性不同，同时温度还影响菌体内生物大分子的物理状态，最终使得2 种菌对花椒提取物抑菌有效成分呈现不同的反应，但温度对2 种菌的抑制作用影响较小[17]。

表4 花椒叶提取物在不同温度下对2 种菌的抑制作用

本研究采用不同提取方法获得花椒叶提取物，在不同条件下对2 种菌的抑制作用进行分析，实验结果显示：采用蒸馏索式提取法获得的花椒叶提取物对金黄色葡萄球菌的抑制作用最佳，采用萃取法获得的花椒叶提取物对大肠杆菌的抑制作用最佳。花椒叶提取物对2 种菌都有一定的抑制作用，对2 种菌来说，提取物浓度越高抑制作用越明显；
温度影响花椒提取物对2 种菌的抑制作用，但是影响较小；
此外，pH 也影响花椒提取物对2 种菌的抑制作用，中性（pH=7.0）至偏碱性（pH=7.0～10.0）条件下，花椒提取物对2 种功的抑制作用明显，而在酸性（pH=4.0～6.0）条件下几乎无抑制作用。

通过实验获得了因提取方法不同，pH、温度和花椒叶提取物浓度不同，对2 种菌的抑菌作用差异的相应数据。以期将花椒叶这一副产物变废为宝，为新的抑菌药品、天然防腐剂的研发提供理论参考，来促进花椒叶产业的发展，使花椒这一经济作物得到全面利用，扩大花椒资源的经济效益[18]。