一株野生金针菇菌种的分离、鉴定与生物学特性研究

冯连荣,张 妍,赵鑫闻,宋立志,梁德军

(1.辽宁省杨树研究所,辽宁 盖州 115213; 2.辽宁省经济林研究所,辽宁 大连 116030)

金针菇(Flammulinafiliformis)是一种常见的食、药用菌,在现代真菌分类系统上,属于担子菌类层菌纲(Hymenomycetes)伞菌目(Agaricales)白蘑科(Tricholomataceae)金针菇属(Flammulina)[1],在自然界中分布广泛,在中国北起黑龙江省,南至云南省,东起江苏省,西至新疆维吾尔自治区均适合金针菇的生长。金针菇是一种木材腐生菌,易生长在柳、榆、白杨树等阔叶树的枯树干和树桩上。金针菇营养丰富,富含多种氨基酸、蛋白质、维生素和矿物质,其中赖氨酸和精氨酸含量尤其丰富,赖氨酸含量对儿童智力和生长发育有良好的促进作用,具有“增智菇”的美誉[2]。金针菇还富含维生素B1、维生素B2、尼克酸、维生素E和维生素C等多种维生素,且富含钙、硒、磷、铁等多种矿物质,其体内多糖具有较好的抗肿瘤作用[3-4]。此外,金针菇还具有提高免疫力、降低胆固醇、保护肝和调节机体代谢水平的作用[3,5],具有相当广阔的开发和应用前景。

目前,关于金针菇的研究主要围绕人工栽培[6-8]、工厂化栽培[9-12]、遗传育种[13-15]、开发利用[16-22]等方面。随着人们生活水平的不断提高,对食品的营养、健康和风味等重视程度也越来越高[23],野生食用菌备受青睐,已成为餐桌上人们争相品尝的美味。但无序采摘、过度采摘导致野生食用菌资源遭到空前破坏,开展野生食用菌人工驯化势在必行。本研究以采集于杨树树桩上的大型真菌为研究对象,通过菌种分离、形态学和分子生物学鉴定、出菇试验,确定该菌种为金针菇。通过单因素试验,研究不同条件对金针菇菌丝生长的影响,为金针菇开发利用提供候选菌种资源。

1.1 供试菌种

供试菌种子实体于2015年4月23日采集自辽宁省凌海市金城苗圃,子实体长于杨树树桩上。

1.2 培养基与试剂

PDA培养基:马铃薯200 g·L-1,葡萄糖20 g·L-1,琼脂20 g·L-1,pH值自然,121 ℃灭菌20 min备用。用于菌种培养、扩繁,以及pH值、温度筛选试验。

基础培养基:葡萄糖20 g·L-1,尿素2 g·L-1,磷酸二氢钾1 g·L-1,硫酸镁0.5 g·L-1,琼脂20 g·L-1,pH值自然,121 ℃灭菌20 min备用。用于碳源、氮源、无机盐和维生素筛选试验。

快捷型植物基因组DNA提取系统(非离心柱型)、大量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自天根生化科技有限公司;ExTaq酶、DL2000 marker、大肠埃希菌(Escherichiacoli)JM109感受态细胞、pMD®-18-T vector购自TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司;引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 菌种分离、纯化

采用组织分离法[24]进行菌种分离,于超净工作台内取子实体菌盖与菌柄交界处组织块,接种至PDA培养基中,置于25 ℃培养箱中黑暗静置培养,菌丝直径达到2 cm左右,进行转接、纯化培养,获得纯种菌丝,将该菌种命名为JC423。获得菌种置于4 ℃冰箱中保存备用。

1.4 菌种鉴定

1.4.1 形态学鉴定

对采集的子实体大小、菌盖形状、颜色、菌褶颜色、菌柄着生方式、质地、孢子印颜色、菌丝颜色等进行测量和记录,参考相关文献[2,25]对JC423进行初步分类。

采用玻片培养法[26]观察JC423的菌丝形态。菌丝培养结束后,用OLYMPUS BX51显微镜观察菌丝有无隔膜,有无锁状联合、孢子形状等。

1.4.2 出菇试验

JC423采集自杨树树桩上,为了验证菌种分离的正确性,设计以木屑、玉米芯为主料的栽培配方,进行出菇试验,配方设计如下:配方1,木屑78%、麸皮20%、石膏1%、糖1%;配方2,玉米芯70%、木屑20%、麸皮8%、石膏1%、糖1%;配方3,木屑40%、玉米芯38%、麸皮20%、石膏1%、糖1%;配方4,木屑70%、麦麸15%、玉米粉13%、石膏1%、糖1%。

接种后,置于25 ℃进行发菌期培养,观察是否长出子实体。

1.4.3 分子生物学鉴定

用ITS序列进行菌种JC423的分子鉴定。用天根快捷型植物基因组DNA提取系统(非离心柱型)进行菌丝DNA提取,利用NanoPro 2010超微量紫外分光光度计测定DNA浓度,进行琼脂糖凝胶电泳检测。按照冯连荣等[26]的反应体系和反应程序进行ITS序列PCR扩增。PCR产物经过凝胶回收,连接至克隆载体pMD®-18-T vector,并转化至大肠埃希菌JM109中,经过蓝白斑筛选和PCR检测,将阳性克隆送至TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司进行测序验证。测序结果登录NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行BLAST比对,下载相似性序列的ITS区域,用Clustalw进行多序列比对,并辅以人工修正,分析时所有参数均为软件默认值。用MEGA7.0软件的N-J(Neihbor-Joining)法构建系统发育树,构建发育树时进行自举检验,重复抽样1 000次。

1.5 生物学特性研究

采用单因素试验,研究不同碳源(果糖、甘露醇、可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖,以不添加碳源为对照)、氮源(蛋白胨、酵母膏、硫酸铵、硝酸铵、尿素,以不添加氮源为对照)、无机盐(氯化钠、硫酸钙、硫酸镁、磷酸二氢钾,以不添加无机盐为对照)、维生素(VB1、VB2、VB3、VB6、VB12,以不添加维生素为对照)、pH值(4、5、6、7、8、9、10)和温度(5、10、15、20、25、30、35 ℃)对JC423菌丝生长的影响。每种处理重复4次,当其中一个处理菌丝长满培养皿时结束试验,每天测量菌丝饼直径,计算菌丝生长速度,同时观察菌丝长势、浓密度等生长指标。

v=d/t。

(1)

式(1)中:v表示菌丝生长速度,mm·d-1;d表示菌丝直径,mm;t表示培养时间,d。

1.6 数据处理

用Excel软件整理数据,用SPSS17.0软件进行单因素方差分析,采用Duncan’s新复极差法进行多重比较。

2.1 纯种菌丝获得

对采集的子实体(图1-A)进行菌种分离,2 d后可见白色菌丝长出,转接纯化3次,获得纯种菌丝,将菌种命名为JC423(图1-B)

图1 JC423子实体和菌落(正面)Fig.1 Sub-entity and colony (front) of JC423

2.2 菌种形态学鉴定

采集的子实体中等大,菌盖直径1.5 cm左右,呈球形或呈扁半球形,菌盖黄褐色,菌肉白色,中央厚,边缘薄,菌褶白色或象牙色,较稀疏,长短不一,与菌柄离生。菌柄中央生,中空圆柱状,稍弯曲,长3.5～5.0 cm,直径0.3～1.5 cm,菌柄基部相连,上部呈肉质、下部为革质,表面密生黑褐色短绒毛,孢子印白色。初步将采集菌种JC423鉴定为金针菇。在PDA平板培养基上JC423菌落白色平展、边缘整齐,菌丝较密、不产生色素,菌丝有隔、分枝和锁状联合,孢子无色、圆柱形(图2)。

图2 JC423 菌丝和孢子Fig.2 Hyphae and spores of JC423

2.3 子实体获得

4个栽培配方均获得了子实体,且与野外采集的子实体形态特征相符(图3)。各配方菌丝长满袋时间相差不大(表1),平均单袋产量在148.44～330.15 g,生物学效率为29.68%～65.18%。

表1 JC423出菇情况Table 1 Fruiting of JC423

图3 JC423室内出菇情况Fig.3 Indoor fruiting situation of JC423

2.4 分子生物学鉴定

2.4.1 ITS序列PCR扩增结果

琼脂糖凝胶电泳检结果表明,JC423菌丝DNA单一无杂质,无降解,浓度为734.68 μg·mL-1,D260/D280约为2,说明DNA质量较好,可以作为PCR反应模板。PCR反应扩增出约700 bp的目的片段(图4),经过连接、转化、蓝白斑筛选,随机挑取14个白色菌落进行菌液PCR,其中有7个扩增出目的条带,将扩增出目的条带的3个阳性克隆送至TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司进行测序。

M,DL 2000 marker;CK,水对照;1～6,JC423 PCR产物。M, DL 2000 marker; CK, Water control, 1-6, JC423 PCR products.图4 JC423 ITS序列PCR产物扩增电泳图Fig.4 PCR amplification electrophoresis of ITS seqence from JC423

2.4.2 序列分析与进化树分析

目的片段序列测定结果显示,片段长度为773 bp,将测序结果在NCBI进行BLAST比对,相似性最高的是F.filiformisstrain F007;搜索获得100条相似性序列,主要菌种为F.filiformis(金针菇)和F.velutipes(毛柄金钱菌)2种,下载部分相似性序列,利用MEGA 7.0软件构建进化树,JC423与序列号为MN337400.1的F.filiformisstrain F007聚为一支(图5),结合形态学特征将JC423鉴定为F.filiformis。测序结果为TCCGTAGGTGAACCTGCG GAAGGATCATTAATGAACTTTGAACTGCTTGTGGCTCTTTGGGCTGTTGCTGACGACGACCTTCACGGGTTTTCGTACGTGCACGTCTGGGGTTGCAGCTTTCTTCGTCCACCTGTGCACACTCTGTAGGTCTGGATACCCCATTGGAAGGGTGCGCTTTTTGCGCTCCCTTTGCCTTCCAGGCCTATGTCTTATAAACACTATAGTATGTAACGAATGTCATTGATTATTGGACTTCACTGTCCTTTAAACTAAATACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAACTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACCTTGCGCCCTTTGGTACTCCGAAGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCAGTAACTTCTCAACCTCCCTCACTTTGTTGTGAGCTGGCGGATTGGACGTGGGGGCTTGCTGGACCTTATCTTTGGGTTCAGCTCCCCTGAAATGCATTAGCAGAAACCGTTACCTTTTGGCGCGCTGCAGCTGTGATAATTATCTACGGCTATGGCTGGGCTGACTGTGTTGTAGCGCTCGTCTCGTCTCTGAAGTGGTTTCGCCTTAGTTGGTGCTTCCCTTTGCCTTCTCTCTCACGAGAGATACCTGTGACGCGAGTGCGCGGGCTATTCCGCTTCTAACCGTCCCCTTGTGGGACAACTATTGACCATTGACCTCAAATCAGTAGACAGCCAGTTCCG。

图5 基于ITS序列的JC423与其他菌种的进化树Fig.5 Evolutionary tree of JC423 and other stains based on ITS sequences

2.5 JC423生物学特性

2.5.1 不同碳源对菌丝生长的影响

5种碳源均可以被JC423菌丝所利用(表2),其中,果糖为碳源时菌丝长势旺,菌丝健壮而浓密,其次是甘露醇、可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖;甘露醇作为碳源时菌丝密度不如可溶性淀粉、蔗糖和葡萄糖。培养基中不加碳源时,菌丝可以生长,但菌丝生长较慢,菌丝密度显著小于添加碳源的培养基。

表2 不同条件对金针菇菌丝生长的影响Table 2 Effects of different conditions on mycelial growth of Flammulina filiformis

2.5.2 不同氮源对菌丝生长的影响

培养基中有无氮源菌丝均可生长,但菌丝生长有差异(表2)。菌丝在蛋白胨和酵母膏作为氮源的培养基上生长快,菌丝浓密、健壮,菌丝生长速度显著快于其他氮源培养基,其次是以硫酸铵作为氮源的培养基,菌丝生长较好。以尿素作为氮源时,菌丝生长较慢,但是菌丝长势尚可。不加氮源时菌丝生长速度慢,菌丝稀薄长势弱。综上,宜选择蛋白胨作为JC423菌丝培养的氮源。

2.5.3 不同无机盐对菌丝生长的影响

JC423菌丝在添加各种无机盐的培养基中均长势良好,各无机盐对菌丝生长影响差异不显著(表2),说明金针菇菌丝生长不受无机盐的影响。

2.5.4 不同维生素对菌丝生长的影响

JC423菌丝在添加不同维生素的培养基中和对照培养基中均长势良好,是否添加维生素对金针菇菌丝生长影响不大,各处理菌丝生长速度差异不显著,菌丝密度和长势也无显著差异(表2)。

2.5.5 不同pH值对菌丝生长的影响

JC423在各pH值条件下均可以生长,在偏酸和偏碱的条件下菌丝长势和菌丝密度较中性条件下好,从菌丝长势和菌丝密度来看,JC423菌丝更适宜偏碱环境,pH值为9～10时菌丝生长速度显著好于其他处理(表2)。

2.5.6 不同温度对菌丝生长的影响

温度对菌丝生长影响差异显著(表2),25 ℃条件下,菌丝浓密,生长速度最快,与其他处理差异极显著。JC423在较低温度下可以生长,但菌丝长势不佳,生长速度慢。超过35 ℃菌丝不能生长。结合菌丝长势和菌丝生长速度,确定25 ℃为JC423菌丝生长的最适宜温度。

金针菇是一类重要的食药用高等大型真菌,是我国最早进行人工栽培的食用菌之一,也是我国食用菌工厂化生产中规模最大、产量最高、发展最快和技术最成熟的栽培种类,产量稳居世界之首[27]。目前我国栽培的金针菇可以分为白色和黄色2种,白色品系有日本金针菇、F21、Fv088、金针菇SD-1、金白1号等。白色金针菇一般生育期较长、产量高,主要用于工厂化栽培。然而,我国金针菇生产对外依赖程度较大,种源大多来自日本和韩国,并且存在菌种退化、适应性差、变异大和性状不稳定等种源问题[28]。黄色品系有杂交19、F135、三明1号、鲁金针1号、金针913等。黄色金针菇生育期短,但子实体整齐度差,主要以农法栽培为主,工厂化栽培品种较少。我国亟需加强金针菇种质资源的开发、优良品种的选育和自主知识产权菌株推广[29]。目前用于人工栽培的食用菌绝大多数是经由野生菌种驯化而来,野生菌种具有抗病性强、生物转化率高等特点,将筛选出来的野生菌株不断进行人工选择,可逐渐培养为栽培种。我国选育的第一个金针菇优良菌种“三明1号”便是从全国28个野生菌株中选育而来。本研究分离获得一个黄色金针菇菌株JC423,为金针菇的人工驯化提供了候选的菌种资源。

截至2021年7月,Species Fungorum索引显示,全球分布的金针菇资源共有30条记录,被认可的金针菇属物种共计17个,包括金针菇F.filiformis、刺头金针菇F.cephalariaePérez-Butrón &Fern.-Vic、芬娜金针菇F.fennaeBas、芬兰金针菇F.finlandicaP.M.Wang et al.、毛腿金针菇F.velutipes(Curtis) Singer等[29]。金针菇属野生子实体形态可塑性强,需要通过形态学和分子序列分析才能有效鉴定[30]。2015年之前公开报道的中国、日本和其他亚洲国家的金针菇被认为与产自欧洲的模式种“Flammulinavelutipes(Curtis) Singer”为同一种。2015年中国科学院昆明植物所真菌多样性与分子进化研究团队基于ITS序列的分子系统学研究认为,东亚的金针菇是欧洲金针菇的一个变种Flammulinavelutipesvar.filiformis[30]。而后2018年该团队基于ITS序列、翻译延伸因子1-α(tef1-α)、rpb2和homeodomain1 (HD1)的部分序列对来自东亚、欧洲和北美的81个金针菇菌种进行了系统发育研究和种属划分,结果显示,从东亚驯化而来的金针菇与原初描述来自欧洲的F.velutipes是两个不同的物种,并将金针菇命名为F.filiformis[31]。本研究分离获得的JC423最初经BLAST比对,相似性最大的均为F.velutipes,撰写本文之际重新进行了BLAST比对,并利用F.velutipes模式菌株进行进化树构建,结果表明,JC423与模式菌株系在不同分支,非相同菌种,与中国河北的F.filiformisstrain F007聚为一支,从而进一步确认JC423为金针菇。

野生食用菌的驯化栽培,依赖于对菌种生物学特性的研究。本研究采用单因素试验,研究了不同碳源、氮源、无机盐、维生素、pH值和温度对金针菇JC423菌丝生长的影响。试验结果显示,金针菇JC423适宜碳源为果糖,与已报道结果略有不同,如金针菇江山一号适宜氮源为面粉[32];最适氮源为蛋白胨,其次是酵母膏,可见有机氮对金针菇生长的促进作用优于无机氮。王德昌[33]研究也表明,黄豆粉、蛋白胨、牛肉浸膏、酵母粉是很好的氮源,对菌丝生长的促进作用优于硝酸铵、硫酸铵等无机氮。JC423最适宜pH值为9～10,与一般文献记载稍有差异,例如何俊等[29]研究表明,野生柳生金针菇和金针菇适宜pH值为6.0。JC423最适宜生长温度为25 ℃,与李良等[34]的研究结果基本一致,其确定了金针菇白色菌株F21菌丝适宜生长温度为25～27 ℃。无机盐和维生素对金针菇菌丝生长影响不大。在无机盐方面,何俊等[29]筛选出的金针菇最适无机盐为硫酸镁;杨云静[32]认为,钾离子和磷离子是金针菇菌丝生长必要的。本研究中添加的无机盐对菌丝长势和生长速度的影响差异不显著。培养基中添加各种维生素后,与对照相比,菌丝更健壮更浓密,但在生长速度方面差异不显著,与杨云静[32]的研究结果基本一致。下一步应该以筛选的对菌丝生长影响较为显著的碳源、氮源、pH值为直接因素进行正交试验,以确定对JC423菌丝生长影响较大的因子,为野生金针菇种质资源开发利用,新品种选育提供一定的数据参考。