一种测定大白菜霜霉病菌对甲霜灵敏感性方法的建立及应用

材料的离体抗药性标准化测定方法。

1材料与方法

1.1供试材料

从山东、河南、江苏、湖北及广东等省的12个地点采集新鲜大白菜霜霉病病叶，经活体接种分离获得50 株寄生霜霉，采用离体子叶冷冻法保藏于青岛农业大学真菌学研究室。以大白菜霜霉病感病品种‘鲁白七号’的离体子叶作为接种材料。大白菜子叶的培养和采集、孢子囊悬浮液的配制及菌株的保藏方法参考杨丽娟等的方法[7]。

1.2供试药剂

98%甲霜灵（metalaxyl）原药由中国农业大学刘西莉教授惠赠。上述药剂预溶于丙酮中并配制成1.0×104 μg/mL的母液，4 ℃保存备用。

1.3离体子叶浸泡法

大白菜新鲜子叶清洗后，用灭菌的吸水纸将子叶上多余的水分吸干，待下述不同处理后，子叶背面朝上整齐地摆放于用吸水纸保湿的直径150 mm培养皿中，每皿10片子叶，每片子叶背面接种10 μL大白菜霜霉病菌孢子囊悬浮液，然后置于15 ℃、12 h光暗交替条件下保湿培养，6 d后调查子叶发病情况，计算病情指数；每处理3次重复，试验重复2次。大白菜离体子叶霜霉病病情分级标准参见杨丽娟等[7]。

1.3.1大白菜霜霉病菌接种浓度

试验设置1×103、1×104和1×105孢子囊/mL等3个接种浓度处理，分别接种于不同培养皿中的子叶背面。

1.3.2展着剂和溶剂

参考朱书生[8]的展着剂及溶剂浓度，配制0.005%吐温20溶液、0.005%吐温20+0.1%丙酮溶液和0.1%丙酮溶液各20 mL。将子叶背面朝下在上述3种溶液中浸泡3 h后取出，于子叶背面接种浓度为1×104孢子囊/mL的孢子囊悬浮液，对照为无菌水处理。

1.3.3离体子叶在药液中浸泡时间

将子叶背面朝下在含有0.005%吐温20+0.1%丙酮的甲霜灵药液（1.15 μg/mL，为甲霜灵抑制大白菜霜霉病菌50%孢子囊萌发的浓度）中分别浸泡1、1.5、2、2.5、3、3.5、4 h后取出，于子叶背面接种浓度为1×104孢子囊/mL的孢子囊悬浮液。

1.3.4离体子叶浸泡法精密度试验

选用3个大白菜霜霉病菌菌株，取准备好的大白菜子叶，将子叶背面朝下浸泡于含有0.005%吐温20+0.1%丙酮的甲霜灵系列浓度梯度药液中3 h后，在子叶背面接种浓度为1×104孢子囊/mL的孢子囊悬浮液。比较各菌株3次重复间EC50的变异系数。

1.4大白菜霜霉病菌对甲霜灵敏感性检测

按照1.3.4中离体子叶浸泡法的步骤测定50株大白菜霜霉病菌对甲霜灵的敏感性。

1.5数据统计与分析

子叶的发病率和病情指数全部通过反正弦转换，采用SAS 8.1软件中的Duncan氏新复极差法，比较不同处理中子叶发病率和病情指数（P=0.05），并进行方差分析。根据子叶病情指数计算各浓度梯度药液对大白菜霜霉病菌的抑制率，查百分率几率值表，以抑制率几率值为纵坐标，药液浓度对数为横坐标，采用Excel 2007软件建立药剂对大白菜霜霉病菌的毒力回归曲线，计算药剂对大白菜霜霉病菌的EC50。

2结果与分析

2.1离体子叶浸泡法的确定

2.1.1大白菜霜霉病菌孢子囊悬浮液接种浓度

比较了3个不同接种浓度的孢子囊悬浮液对子叶发病的影响，试验结果表明，3个处理的发病率之间差异不显著， 但处理之间的病情指数差异显著。3个处理的子叶发病率较高，为93.33%～100%；接种浓度为1×103孢子囊/mL的子叶发病较轻，病情指数为38.52，发病面积较小；接种浓度为1×104孢子囊/mL的子叶病情指数最高，为78.52，霉层均匀地布满整片子叶；接种浓度为1×105孢子囊/mL的子叶只有接种点部位发病，病斑并未扩展至整片子叶，部分叶片接种点腐烂。接种浓度为1×103孢子囊/mL与1×105孢子囊/mL的子叶发病面积均小于1×104孢子囊/mL。因此，选择1×104孢子囊/mL作为离体子叶浸泡法的接种浓度（表1）。

2.1.2表面展着剂和有机溶剂

由表2可知，大白菜子叶在吐温20和丙酮及其组合等3种溶液处理后，子叶的发病率均为100%，其中含有0.005%的吐温20的处理与对照的病情指数相等，0.005%的吐温20+0.1%的丙酮处理的病情指数比对照偏高，但发病率和病情指数与对照均无显著性差异。表明在进行子叶浸泡处理时，浓度为0.005%的吐温20可以作为表面展着剂，丙酮可以作为溶解原药的有机溶剂。

2.1.3离体子叶浸泡时间

如表3所示，在甲霜灵药液中分别浸泡1～4 h的大白菜离体子叶接种后，浸泡时间在1～2 h、2.5 h、3～4 h三者之间的子叶的病情指数和抑制率差异均显著。浸泡1 h的子叶病情指数最高，为67.41，浸泡4 h的子叶病情指数最低为27.41。浸泡1～2 h的子叶发病较重，抑制率小于50%；浸泡3 h时，药液对子叶病情指数的抑制率为55.43%，最接近50%；浸泡3.5～4 h的子叶病情指数差异不显著，但药液对子叶病情指数的抑制率显著大于50%。故选用浸泡3 h作为最佳浸泡时间。

2.2大白菜霜霉病菌对甲霜灵的敏感性检测

采用离体子叶浸泡法测定了50株大白菜霜霉病菌对甲霜灵的敏感性，结果表明，50个菌株对甲霜灵的EC50值范围为0.024 3～14.302 1 μg/mL，平均EC50为（2.218 9±2.884 3）μg/mL，最敏感菌株是HN1，其EC50为0.024 3 μg/mL，最不敏感菌株是CY4，其EC50为14302 1 μg/mL，是最敏感菌株的588.56倍。由表5可知，有16个菌株对HN1的EC50倍数超过了100倍，占所测菌株的32%。同时，由图1可以看出，大白菜霜霉病菌对甲霜灵的敏感性频率分布并不呈单峰曲线，在0～0.5 μg/mL、1.5～2.5 μg/mL及>6.0 μg/mL的EC50范围内均出现了峰值。表明大白菜霜霉病菌的供试菌株对甲霜灵出现了敏感性分化，已经有抗药性亚群体产生（表5）。

3结论与讨论

本文通过对大白菜霜霉病菌孢子囊悬浮液接种浓度、子叶在药液中浸泡时间以及药液中表面展着剂和有机溶剂的初步研究，建立了一种大白菜霜霉病菌对甲霜灵敏感性检测的新方法—离体子叶浸泡法。采用0.005% 吐温20作为表面展着剂，低于0.1%的丙酮作为有机溶剂配制原药的母液，以大白菜霜霉病感病品种‘鲁白七号’的离体子叶作为接种材料，将子叶背面朝下在药液中浸泡3 h后， 于叶背接种10 μL浓度为1×104孢子囊/mL的悬浮液。15 ℃，12 h光暗交替保湿培养6 d后调查病情。本方法与叶盘法比较具有试验周期短，精密度高、重复性好、稳定性较高，且操作相对简便等特点。采用本方法可以准确、可靠地测定甲霜灵对大白菜霜霉病菌的毒力和检测田间大白菜霜霉病菌对甲霜灵敏感性，为杀菌剂作用机制和抗药性研究及治理提供了技术支撑，具有重大的社会经济意义。

参考文献

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[6]Locher F J， Lorenz G.Methods for monitoring the sensitivity of Botrytis cinerea to dicarboximide fungicides[EB].FRAC Methods for Monitoring Fungicide Resistance，1996，26：341354.

[7]杨丽娟，梁晨，李宝笃. 大白菜霜霉病菌孢子囊的保藏方法[J]. 菌物学报， 2013， 32（6）：10711078.

[8]朱书生. 黄瓜霜霉病菌对氟吗啉的抗药性风险评估及氟马啉作用机制初探[D]. 北京：中国农业大学， 2004.