黄芩提取物对H22移植瘤小鼠的影响

材料

1.1 动物及细胞株

SPF级2月龄昆明种小鼠72只，雌雄各半，体质量（20±2）g，甘肃中医药大学实验动物中心，合格证号SCXK（甘）2011-0001。小鼠肝癌H22瘤株，中国医学科学院药物研究所。

1.2 药物

2年生黄芩根，11月初采自甘肃陇西，经甘肃中医药大学杜弢教授鉴定为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根。将黄芩用蒸馏水洗净后切片，置于烘箱（40 ℃）烘干至恒重，研碎后过60目筛备用。70%乙醇加热回流3次，每次回流2 h，将3次提取液合并浓缩至无醇味，再用蒸馏水调至1∶1浓度，4 ℃冰箱保存。分光光度法测得黄芩总黄酮含量为19.48%。氟尿嘧啶注射液（5-Fu），规格：250 mg/10 mL，上海旭东海普药业有限公司，批号20131210。

1.3 试剂

考马斯亮蓝、总抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）试剂盒，南京建成生物工程研究所；正常熔点的琼脂糖、低熔点的琼脂糖，美国Sigma公司；台盼蓝、三羟甲基氨基甲烷、二甲基亚砜、溴化乙锭均为国产分析纯。

1.4 仪器

DYY-Ⅲ型电泳仪，北京六一仪器厂；CKX41-F32FL荧光倒置显微镜，日本奥林巴斯公司；VIS-723N型紫外可见分光光度计，北京瑞利分析仪器有限公司。

2 实验方法

2.1 H22移植瘤模型制备

常规方法复苏H22小鼠肝癌细胞，取0.2 mL细胞悬液注射到小鼠腹腔内，连续传2代。无菌操作取第2代腹水，0.4%台盼蓝染色，计数活细胞率>90%，再用无菌生理盐水稀释，调整细胞密度为1×107个/mL，取0.2 mL瘤细胞悬液接种到60只昆明种小鼠的右前肢腋窝皮下。

2.2 分组及给药

接种后第2日，将60只小鼠，雌雄各半，随机分为模型组、5-Fu组和黄芩提取物低、中、高剂量组，每组12只。另取12只正常小鼠设为对照组。黄芩提取物低、中、高剂量组每日分别以50、100、200 mg/kg剂量给予小鼠黄芩提取物灌胃，每日1次；5-Fu组按25 mg/kg剂量隔日灌胃给药1次；对照组和模型组每日给予0.2 mL/10 g生理盐水灌胃。每日记录小鼠的活动状况及体质量变化。连续10 d。

2.3 检测指标

末次给药后，禁食不禁水16 h，各组小鼠称重，摘眼球取血，脱颈处死小鼠。

2.3.1 抑瘤率和脏器指数测定 剖取瘤块，生理盐水洗净表面残血，称重，计算抑瘤率[（模型组平均瘤质量-给药组平均瘤质量）÷模型组平均瘤质量×100%]。剖取胸腺和脾脏，生理盐水洗净表面残血，用滤纸吸干，电子天平称重，计算脏器指数。脏器指数=脏器质量÷体质量。

2.3.2 血清总抗氧化能力、超氧化物歧化酶活性及丙二醛含量测定 分离血清，4 ℃冷藏保存，用于T-AOC、SOD活性、MDA含量的测定。SOD活性测定采用黄嘌呤氧化酶法；MDA含量测定采用硫代巴比妥酸法（TBA）法；比色法检测血清T-AOC，组织蛋白含量测定采用考马斯亮蓝法，具体测定流程按试剂盒说明书进行。

2.3.3 外周血淋巴细胞DNA损伤检测 采用单细胞凝胶电泳法，具体流程参照Singh等[5]描述的方法稍加改进，选择尾长、尾矩、Olive尾矩为DNA损伤指标。

3 统计学方法

采用SPSS13.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 黄芩提取物对移植瘤小鼠肿瘤生长的影响

与模型组比较，不同剂量黄芩提取物对肝癌H22移植瘤小鼠瘤质量均有一定的抑制作用，其中黄芩提取物中、高剂量组抑瘤作用显著（P<0.01）；黄芩提取物各剂量组小鼠瘤质量均明显高于5-Fu组（P<0.01），黄芩提取物各剂量组抑瘤率均低于5-Fu组。结果见表1。

4.2 黄芩提取物对移植瘤小鼠体质量及免疫器官指数的影响

与模型组比较，实验末期5-Fu组小鼠体质量明显下降（P<0.01），黄芩提取物中、高剂量组小鼠体质量则有所增加，黄芩提取物中、高剂量组小鼠胸腺和脾脏指数明显升高（P<0.05，P<0.01），5-Fu组小鼠胸腺指数和脾脏指数明显降低（P<0.01），也明显低于黄芩提取物中、高剂量组（P<0.01）。结果见表2。

4.3 黄芩提取物对移植瘤小鼠血清抗氧化指标的影响

与对照组比较，模型组、5-Fu组、黄芩提取物各剂量组小鼠血清T-AOC均明显降低（P<0.01）；与模型组比较，黄芩提取物中、高剂量组小鼠血清T-AOC明显升高（P<0.01），而5-Fu组小鼠血清T-AOC明显降低（P<0.01）。模型组、5-Fu组、黄芩提取物各剂量组小鼠血清SOD活性均低于对照组，其中模型组、5-Fu组、黄芩提取物低剂量组与对照组比较差异显著（P<0.01）；黄芩提取物各剂量组小鼠血清SOD活性均高于5-Fu组，其中中、高剂量组差异有统计学意义（P<0.01）。与对照组比较，模型组、5-Fu组、黄芩提取物各剂量组小鼠血清MDA含量均明显升高（P<0.01），黄芩提取物中、高剂量组血清MDA含量明显低于模型组（P<0.01）。结果见表3。

4.4 黄芩提取物对移植瘤小鼠外周血淋巴细胞DNA损伤的影响

与对照组比较，模型组、5-Fu组、黄芩提取物各剂量组小鼠外周血淋巴细胞DNA尾长、尾矩、Olive尾矩均增加，除黄芩提取物高剂量组DNA尾长外，其余各组差异均有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，黄芩提取物中、高剂量组小鼠外周血淋巴细胞DNA尾长、尾矩、Olive尾矩均明显降低（P<0.01），而5-Fu组小鼠外周血淋巴细胞DNA尾长、尾矩、Olive尾矩则明显升高（P<0.01）。结果见表4。

5 讨论

恶性肿瘤是一类危害人类健康的常见疾病，居人类疾病病死率的第1位。在肿瘤疾病的治疗中，化疗可改善临床症状，提高生存质量及延长生命。化疗药物在杀死大量肿瘤细胞的同时，对机体的正常组织和细胞也有不同程度的损伤作用，主要表现在可引起免疫器官萎缩、免疫功能减退、造成正常淋巴细胞大量减少、产生一定的细胞毒性等。因此，在最大限度杀灭肿瘤细胞的同时，修复或增强机体的免疫功能，减轻对正常组织和细胞毒害作用，是治疗肿瘤的关键所在。

本实验结果表明，不同剂量黄芩提取物对小鼠H22肝癌移植瘤生长均有明显抑制作用，黄芩提取物的抑瘤作用弱于5-Fu；但不同的是，5-Fu组小鼠体质量明显减轻，胸腺指数和脾脏指数显著下降，而黄芩提取物中、高剂量组体质量、胸腺指数和脾脏指数下降不明显，表明黄芩提取物用药安全性较好。黄芩提取物中、高剂量组小鼠胸腺指数和脾脏指数显著高于模型组，表明黄芩提取物中、高剂量能够在一定程度上改善肿瘤对机体免疫器官的伤害，修复或增强小鼠的免疫功能。

研究表明，自由基产生和消除失衡与肿瘤发生、发展关系密切。当机体处于肿瘤的发生、发展等病理过程中，机体抗氧化能力减弱，自由基产生速度超过了机体清除的能力，机体内累积过多的自由基可直接损伤DNA，也可通过脂质过氧化产物间接损伤DNA。当DNA损伤累积到一定程度后可导致细胞功能改变、基因毒性及肿瘤启动等多种损伤[6-8]。本实验结果显示，模型组小鼠血清T-AOC、SOD活性显著降低，MDA含量显著升高，外周血淋巴细胞DNA尾长、尾矩、Olive尾矩明显增加，表明肿瘤的发生对机体造成了氧化损伤。给予中、高剂量黄芩提取物后，移植瘤小鼠T-AOC、SOD活性明显升高，MDA含量显著降低，外周血淋巴细胞DNA尾长、尾矩、Olive尾矩明显降低，提示黄芩提取物中、高剂量可改善或提高机体的抗氧化能力，以清除体内过多产生的自由基，进而保护淋巴细胞DNA结构的稳定。

综上所述，黄芩提取物具有明显的抗肿瘤作用，其作用机制可能与减轻或改善肿瘤细胞对机体正常组织细胞的伤害、修复或增强小鼠的免疫功能及提高机体抗氧化损伤能力有关。与常规化疗药物相比，黄芩提取物在一定剂量下对小鼠无明显不良影响，是其优势所在。然而肿瘤的形成和发展十分复杂，涉及多个脏器，多种生化指标的改变，单纯依靠黄芩提取物治疗，并不能完全控制肿瘤的生长，是否可以将黄芩提取物与化疗、放疗联用，以增强对肿瘤的控制效果，延长移植瘤小鼠生存时间，还有待进一步探讨。

参考文献：

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[5] Singh NP， McCoy MT， Tice RR， et al. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells[J]. Exp Cell Res，1998，175：184-191.

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（收稿日期：2015-01-23）

（修回日期：2015-02-12；编辑：华强）