摘 要：鳜鱼稀少、名贵、难养，是孔雀石绿（MG）及其主要代谢物隐色孔雀石绿（LMG）残留重灾区。为确定鳜鱼样品中用于开展能力验证药物的适宜储存条件和运输温度条件，最大限度消除外因对MG及LMG检测结果的影响，保证结果的可靠性，以鳜鱼肌肉为研究对象，开展了MG及LMG残留降解规律研究。实验分析了MG和LMG在3种浓度（5.0、10.0、50.0 μg/kg）和3种贮藏条件（室温20～25℃，冷藏0～4℃和冷冻-18℃）下随时间的降解规律。实验结果表明，不同浓度的MG和LMG均有不同程度的降解，但因贮藏条件的不同，降解速率各不相同。在各种贮藏条件和不同浓度加标情况下，鳜鱼样品中LMG代谢消除速率均显著慢于MG；且因LMG的毒性远大于MG，建议将LMG作为残留检测的主要标志物。受酶活性高低的影响，贮藏条件对MG和LMG代谢的影响较大，降解速率为常温>冷藏>冷冻。如果样品能尽快进行检测，即可在常温条件下进行短期保存；如样品不能尽快安排检测，则须冷冻保存，尽量保持样品的原有属性。
关键词：孔雀石绿；隐色孔雀石绿；残留；降解；鳜鱼
中图分类号：X592 文献标识码：A 文章编号：1006-060X（2014）09-0069-06
孔雀石绿（Malachite Green，MG）为三苯甲烷类工业染料，同时还是一种有效杀灭霉菌的染料类药物，对真菌和寄生虫有较好的杀灭效果[1]，在水产业得到了广泛应用。因其是3个芳香胺的聚合物，具有潜在致癌、致畸、致突变作用[2-4]。自1980年发现孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿（Leuco Malachite Green，LMG）具有潜在的致癌性以来，美国、日本以及英国等许多国家已禁止其用于水产养殖业。中华人民共和国农业行业标准 NY5071-2002《无公害食品渔用药物使用准则》已将孔雀石绿列为禁用药物[5]，在水产品中“不得检出”。但是，由于孔雀石绿效高价廉、管理力度不够、替代品少等原因，不少渔民还在小范围使用，这不可避免地带来了其在水产品中残留和环境污染的问题[6]。
鳜鱼肉质细嫩且丰厚坚实，富含蛋白质，味道鲜美，且内部无胆少刺，故自古以来就是宴席上的美味佳肴。鳜鱼还可以补五脏、益脾胃、充气胃、疗虚损，适用于气血虚弱体质，可治虚劳体弱、肠风下血等症，是一种名贵的鱼类[7]。目前国内外消费市场对鳜鱼需求量日益增长，但鳜鱼终生以活鱼虾为食，野生资源量因受多种因素影响而日趋衰减；养殖技术含量高，易感染疾病，死亡率高，产量远远低于普通鱼类。因孔雀石绿对真菌和寄生虫有较好的杀灭效果，在鳜鱼养殖和运输过程中可以减少其感染疾病的几率，保持鲜鱼的高成活率，故在鳜鱼中经常被使用。在检出孔雀石绿的水产品中[8]，鳜鱼是检出率最高的品种之一。华永有等[9]对市售淡水鱼进行孔雀石绿及其代谢物残留量调查研究时发现，鳜鱼中孔雀石绿的检出率竟高达92.9%，表明鳜鱼已经成为孔雀石绿及其代谢物残留的重灾区。以往的研究多集中在实验活体动物的代谢上，而不同贮藏条件对鳜鱼中孔雀石绿及其代谢物检测结果的影响还没有相关报道。本实验通过研究不同浓度的孔雀石绿在不同贮藏条件下的鳜鱼加标样品中的稳定性，以期筛选出适宜开展能力验证的药物品种的储存条件和运输温度条件，最大限度消除外因对检测结果的影响，以保证结果的公正性。
1 材料和方法
1.1 试验材料
1.1.1 主要仪器 高效液相色谱-三重串联四级杆质谱仪，配ESI 源（TSQ Quantum Access，赛默飞世尔公司）；步琪平行蒸发仪（Q-101，瑞士buchi公司）；超声波清洗仪（KQ-1000DE，昆山市超声仪器有限公司）；快速混匀器（SK-1，江苏中大仪器厂）；高速冷冻离心机（CR22GⅢ，日本TITACHI公司） ；固相萃取装置（20-Port SPE Manifold，美国安捷伦仪器设备公司）；天平（AB135-S，梅特勒-托利多仪器上海有限公司）。
1.1.2 试 剂 孔雀石绿（德国Witega实验室公司，纯度>99%），氘代孔雀石绿（德国Witega实验室公司，纯度>99%），隐色孔雀石绿（德国Witega实验室公司，纯度>99% ），氘代隐色孔雀石绿-D6（德国Witega实验室公司，纯度>99%）；乙腈（色谱纯，美国天地试剂公司）；中性氧化铝柱（1 g，3 mL，美国SUPELCO公司）；无水乙酸铵（色谱纯，美国天地试剂公司，纯度>98%）；水为娃哈哈超纯水。
1.2 试验方法
1.2.1 标准溶液的配制 标准贮备液：分别准确称取10.0 mg孔雀石绿、隐色孔雀石绿、氘代孔雀石绿、氘代隐色孔雀石绿，用乙腈溶解，定容至100.0 mL，配制成100.0 μg/mL的标准贮备液，-18℃避光保存。混合标准工作溶液：用乙腈稀释上述混合标准贮备液，配制成浓度为1.0、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 μg/kg的孔雀石绿、隐性孔雀石绿及内标浓度为2.0 μg/kg混合标准溶液，置于-18℃避光保存。
1.2.2 样品前处理 鲜活鳜鱼，来自湖南省水产科学研究所渔场。将鱼去磷去皮后，沿脊背取肌肉部分，捣碎样品均质，分别加入一定浓度孔雀石绿和隐色孔雀石绿标准液，制成添加水平分别为5、10、50 μg/kg的加标样品，充分涡旋混合均匀，将3种加标浓度水平的样品分别置于室温（20～25℃ ）、冷藏（0～4℃ ） 和冷冻（- 18℃ ） 条件下。在室温（20～25℃ ） 条件下，分别于第0、1、2、3、4、5、6 天取出；冷藏（0～4℃ ） 条件下，分别于第0、1、2、3、5、7、9天取出；冷冻（-18℃ ） 条件下，分别于第0、1、2、3、5、10、15、20、30、40、50、60天取出。每个样品设3个平行样。按下述步骤进行检测分析。
1.2.3 样品处理 实验按GB/T19857—2005水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定（液相色谱-串联质谱法）中鲜活水产品的处理步骤进行。
1.3 测 定
1.3.1 高效液相色谱-质谱联用仪质谱条件 液相色谱条件：色谱柱：Hypersil Gold柱（150 mm×2.1 mm，3 μm）；柱温：35℃；进样量：10 µL；流动相：A——乙腈，B——5 mmol/L 乙酸铵（含0.1%的甲酸）；流速：0.30 mL/min。洗脱程序（A）：0～1.0 min，10%；1.0～8.0 min，10%～90%；8.0～10.0 min，90%～10%；10.0～15.0 min，10%。
质谱条件：扫描模式：加热电喷雾离子源（HESI），正离子模式（Positive polarity）；喷雾电压（Spray voltage）：3 500 V；鞘气压力（ Sheath gas，N2）；40 u，辅助气流量（Aux gas，N2）：10 u；离子传输毛细管温度（Capillary temperature）：340℃ ；源内诱导解离电压：6 V；碰撞气（Collision， Ar）：1.5 u；离子吹扫气（ Ion sweep gas，N2）：0 u；扫描模式：选择反应监测（SRM）；监测离子对：孔雀石绿m/z 329/313、329/208（定量离子），隐色孔雀石绿m/z 331/316、331/239（定量离子），氘代孔雀石绿 m/z 334/318（定量离子），氘代隐色孔雀石绿 m/z 337/322（定量离子）。
1.3.2 液相色谱—串联质谱测定 按照1.3.1液相色谱-串联质谱条件测定样品和混合标准工作溶液，正离子模式扫描，选择反应监测（SRM），内标法定量。在上述色谱条件下，孔雀石绿、氘代孔雀石绿、隐色孔雀石绿、氘代隐色孔雀石绿分离度及峰形良好，参考保留时间分别为6.83、6.82、9.17、9.23 min。标准溶液的离子流图如图1所示。
2 结果与分析
2.1 常温贮藏对不同浓度MG和LMG代谢降解的影响
在常温下，鳜鱼样品放置2～3 d开始产生异味，放置6 d后，已经完全腐败，所以选用6 d作为研究时段。从表1中可以发现，经过放置6 d，3种浓度水平的MG和LMG均有不同程度的降解，其中MG的降解程度要比LMG的大得多：低浓度的MG（加标浓度：5.00 μg/kg）由5.34 μg/kg降解至2.55 μg/kg，与初始检测浓度相比降低了52.25%，而低浓度的LMG则由5.60 μg/kg降解至3.98 μg/kg，降解了29.06%；中浓度的MG（加标浓度：10.00 μg/kg）经过6 d后，检测的结果为6.24 μg/kg，降解了36.78%，中浓度的LMG则由10.08 μg/kg降解至8.85 μg/kg，降解了20.8%；高浓度的MG（加标浓度：50.00 μg/kg）经过6 d后，测定值为25.60 μg/kg，最终降解了46.89%，而高浓度的LMG检出值为37.60 μg/kg，降解了28.11%。
2.2 冷藏对不同浓度MG和LMG代谢降解的影响
在冷藏条件下，鳜鱼样品经过9 d接近腐败。从表2中可以看出，经过9 d的冷藏，3种浓度水平的MG和LMG降解的程度不一样，但总体来说LMG的降解程度比MG的要小一些：低浓度的MG（加标浓度：5.00 μg/kg）由5.35 μg/kg降解至2.01 μg/kg，与初始检测浓度相比降低了62.43%，而低浓度的LMG则由5.41 μg/kg降解至3.25 μg/kg，降解了39.93%；中浓度的MG（加标浓度：10.00 μg/kg）经过9 d后，检测的结果为5.54 μg/kg，降解了45.15%，中浓度的LMG则由11.00 μg/kg降解至8.01 μg/kg，降解了27.18%；高浓度的MG（加标浓度：50.00 μg/kg）经过9 d后，测定值为29.40 μg/kg，最终降解了42.91%，而高浓度的LMG检出值为39.40 μg/kg，降解了26.22%。
2.3 冷冻对不同浓度MG和LMG代谢降解的影响
在冷冻情况下，鳜鱼样品可以长时间保存。3种浓度水平的鳜鱼加标样品在冷冻条件下存放60 d，样品无腐败现象。由表3可知，与前两种放置条件相似，3种浓度水平的MG和LMG降解的程度不一样，LMG的降解程度比MG的要小一些：低浓度的MG（加标浓度：5.00 μg/kg）由5.26 μg/kg降解至1.34 μg/kg，与初始检测浓度相比降低了74.52%，而低浓度的LMG则由5.53 μg/kg降解至3.12 μg/kg，降解了43.58%；中浓度的MG（加标浓度：10.00 μg/kg）经过60 d后，检测的结果为3.90 μg/kg，降解了62.14%，中浓度的LMG则由10.20 μg/kg降解到6.21 μg/kg，降解了39.12%；高浓度的MG（加标浓度：50.00 μg/kg）经过60 d后，测定值为25.00 μg/kg，最终降解了52.29%，而高浓度的LMG测定值为32.90 μg/kg，降解了38.50%。
3 讨 论
3.1 隐色孔雀石绿代谢降解的速率显著慢于孔雀石绿
在各种贮藏条件和不同浓度加标情况下，隐色孔雀石绿代谢消除速率均显著小于孔雀石绿，如图2、图3所示。例如，在常温下，低浓度孔雀石绿代谢速率为0.47 μg/（kg·d），而隐色孔雀石绿差不多是其1/2，为0.27 μg/（kg·d），隐色孔雀石绿的代谢速率远远低于孔雀石绿的代谢速率。Alboralila等[10]研究发现隐色孔雀石绿在虹鳟体内的消除速率显著慢于孔雀石绿。在血浆中，孔雀石绿在用药后1～2 d内降到检测限（5 μg/kg） 以下，而隐色孔雀石绿在4周后仍能检测到。邱绪建等[11]研究发现孔雀石绿在鲫鱼体内的代谢呈对数曲线下降，孔雀石绿在鲫鱼体内代谢时间短，大约10 d能完全消除。而隐色孔雀石绿消除曲线较孔雀石绿平缓，消除时间较长，至30 d时仍有17.7 μg/kg的残留。本实验结果与以前的报道一致。隐色孔雀石绿代谢消除慢于孔雀石绿，同时由于隐色孔雀石绿的毒性远大于孔雀石绿[12] ，因此建议选用隐色孔雀石绿作为残留检测的主要标志物。
3.2 贮藏条件对孔雀石绿及其代谢物的降解影响
相同浓度下的加标在不同的贮藏条件下，代谢速率差异较大。图4、图5分别显示了孔雀石绿和隐色孔雀石绿的降解速率，常温条件的降解速率>冷藏条件的降解速率>冷冻条件的降解速率。酶的活性受温度影响很大，常温下，酶的活性强，对促进孔雀石绿及隐色孔雀石绿降解的作用明显，因此两者降解速率较大；反之，当温度低时，二者的降解速率变慢。此外，受水温、盐度、pH值、溶氧、鱼种以及药物浓度的影响[11]，孔雀石绿及其代谢物的代谢速率会不一样。在冷冻状态下，短时间内孔雀石绿的稳定性较好，不易代谢降解。因此，在进行鳜鱼样品的检测分析时，建议尽快进行检测，如若不能满足条件，则需要对样品进行冷冻处理，从而保证样品的检测结果最大限度地接近原来的属性，避免因代谢降解而影响检测结果。
3.3 不同浓度水平对孔雀石绿及隐色孔雀石绿降解的影响
不同浓度添加的样品代谢速率不太一致。在常温下，孔雀石绿和隐色孔雀石绿一致，都是低浓度降解速率>高浓度降解速率>中浓度降解速率；在冷藏条件下，孔雀石绿降解情况为低浓度>高浓度>中浓度，而隐色孔雀石绿则为低浓度>中浓度>高浓度，不过中浓度和高浓度的降解速率相差不大；在冷冻情况下，均为低浓度>中浓度>高浓度（图6）。由图6可知，在冷冻条件下，孔雀石绿降解速率较慢，在样品的保存中，可选择将样品处于-18℃冷冻保存。不同浓度添加量的降解不一样，穆迎春等[13]利用草鱼和鲤鱼研究孔雀石绿在不同贮藏条件下的降解发现，草鱼和鲤鱼在不同浓度下降解速率均不相同。不同浓度水平下，孔雀石绿降解速率可能与样品基质有关系[13-14]。有研究表明，在代谢过程中，隐色孔雀石绿与孔雀石绿可以相互转换，由孔雀石绿的代谢机理得知，隐色孔雀石绿在氧化酶的作用下被重新氧化成孔雀石绿[14]，而孔雀石绿在还原剂（如硼氢化钾）作用下代谢成隐色孔雀石绿，高浓度水平时，两者相互转化的水平较高，降解速率较慢。此外，还有研究表明，孔雀石绿（或隐色孔雀石绿）的降解速率主要依赖于鱼体的脂肪含量，脂肪越高，降解速率越快[13]；鳜鱼脂肪含量较低[14]，故相对于鳕鱼和鲤鱼等脂肪量高的鱼类，降解速率较慢。
参考文献：
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[4] Rao K V K. Inhibition of DNA synthesis in primary rat hepatocyte cultures by malachite green： a new liver tumor promoter [J]. Toxicology Letters，1995，81 （2-3）： 107-113.
[5] 中华人民共和国农业部. 中华人民共和国农业部公告第193号（食品动物禁用的兽药及其化合物清单）[EB/OL].http：//.cn/qkpdf/hnkx/hnkx201409/hnkx20140920-2.pdf" style="color:red" target="_blank">原版全文
