蝇蛆蛋白混合物对美洲鳗鲡非特异性免疫功能的影响

陈 杰，陈子廷，赵 甜，王方海，李广宏

( 中山大学 生命科学学院，广东 广州 510275 )

鳗鲡营养丰富，肉质鲜美，素有“水中人参”、“软黄金”之美誉，也是我国单项出口创汇最多的品种之一[1]。然而随着集约化养殖程度的不断提高，鳗鲡病害发生日益频繁，病死率逐年上升。为控制病害，养殖户被迫大量使用抗生素等化学合成药物。虽然使用这些药物可有效预防鳗鲡各种病害，提高养殖成活率，但也给鳗鲡健康养殖带来不利影响，导致部分鳗鲡产品药物残留超标，严重影响我国鳗鲡产品出口创汇[2-3]。因此，寻找安全、可靠、无公害、无残留的疾病防控方法已成为目前我国鳗鲡养殖业亟待解决的难题。

家蝇(Muscadomestica)喜欢生活在阴暗潮湿、杂菌丛生的环境中，但却鲜见家蝇因自身感染病原体而引起大量死亡的现象，这益于其强大的先天性免疫系统，而这种强大的免疫力与其体内产生的抗菌肽、凝集素和溶菌酶等有关[4]，因此利用蝇蛆蛋白或抗菌肽开发安全、高效的新型免疫增强剂以提高养殖动物的抗病力已引起国内外学者广泛关注。已有研究表明，蝇蛆蛋白或抗菌肽可以增强龟鳖类[5-6]、虾类[7-11]、鱼类[12-19]、海参[20]和畜禽[21-25]等的免疫力，是一种既能为养殖动物提供营养，又可增强养殖动物机体抗病力的天然免疫增强剂。国内外仅陈红等[2]研究了蝇蛆抗菌肽对鳗鲡(Anguillajaponica)生长性能的影响，指出蝇蛆抗菌肽可显著提高鳗鲡生长性能，降低养殖成本，是鳗鲡饲料的一种优质蛋白添加剂。而有关蝇蛆蛋白对鳗鲡非特异性免疫的影响，迄今尚未见报道。鉴于此，笔者研究了蝇蛆蛋白混合物对美洲鳗鲡(A.rostrata)非特异性免疫功能的影响，以期为利用蝇蛆蛋白开发鳗鲡免疫增强剂提供基础数据。

1.1 材料

蝇蛆蛋白：蝇蛆蛋白由本实验室提供，蝇蛆营养组成见表1、表2；
美洲鳗鲡：试验鱼购自湖北省武汉市科洋生物工程有限公司，体质量(95.0±5.0) g，体长(35.8±0.4) cm；
饲料：美洲鳗鲡饲料购自广东省佛山市顺德成冠饲料有限公司，饲料营养组成见表3；
嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)：菌株购自杭州递思艾生物科技有限公司，菌株编号为ATCC@35654TM*。

表1 蝇蛆营养组成(鲜品) %

表2 蝇蛆营养组成(干物质) %

表3 美洲鳗鲡基础饲料营养水平(干物质) %

1.2 试验方法

1.2.1 饲料配制与试验设计

将麦麸养殖并分离得到的蝇蛆用0.1%高锰酸钾消毒，清洗干净，滤干，用胶体磨磨浆，离心浓缩，然后在虫浆中加入0.3%壳寡糖、1.5%大豆卵磷脂、1.5%维生素混合物和2.0%无机盐混合物，于搅拌机中混合均匀，制得蝇蛆蛋白混合物。测定蝇蛆蛋白混合物营养组成(表4)，分装，-20 ℃保存待用。

表4 蝇蛆蛋白混合物营养组成 %

试验设5个处理组，分别为基础饲料组(对照组)、5%蝇蛆蛋白添加组、10%蝇蛆蛋白添加组、15%蝇蛆蛋白添加组和20%蝇蛆蛋白添加组。投喂时各处理组先准确称取基础饲料和蝇蛆蛋白混合物(表5)，混合均匀，然后按饲料∶水=1∶1.2(质量比)加入适量水(由于蝇蛆蛋白混合物含50.2%的水分，各试验组具体加水量见表5)，用手拌匀，配制成具有良好延展性和黏弹性的料团，现配现用。

表5 各试验组基础饲料、蝇蛆蛋白混合物和水的比例(g/220 g料团)

1.2.2 饲养管理

试验于武汉市科洋生物工程有限公司鳗鱼养殖场的室内水泥养殖池中进行。试验开始前，将购买的美洲鳗鲡置水泥池中驯养，驯养期间投喂鳗鲡基础饲料。驯养7 d后，挑选体质量(95.0±5.0) g、体长(35.8±0.4) cm、体格健壮的美洲鳗鲡750尾用于试验。置于1 m×1 m×1 m网箱中饲养，每网箱放养美洲鳗鲡50尾，所有网箱挂于同一水泥池中养殖，网口高于水面15 cm。试验分5组，每个试验组设3个平行，每个平行50尾鱼。每日于8:00和17:00投喂，将饵料加少量水揉成面团后投喂，日投饵量为美洲鳗鲡体质量的2%。24 h不间断充气增氧，每2 d换水1次，换水量1/3。试验期间光照为室内自然光源，水温25～28 ℃，pH 7.8±0.2，溶解氧>7.0 mg/L，氨氮<0.21 mg/L。试验周期为60 d。

1.2.3 样品采集及处理

养殖试验结束后，饥饿美洲鳗鲡24 h，尾静脉取血。每网箱随机取美洲鳗鲡15尾，经间氨基苯甲酸乙脂甲磺基盐麻醉后用1 mL一次性注射器自美洲鳗鲡尾静脉采血，随机将3尾美洲鳗鲡的血淋巴置于同一无菌EP管中，室温静置1 h，然后4 ℃静置8 h，4 ℃、5000 r/min(离心半径10 cm)离心10 min，取血清，-80 ℃保存待用。

1.2.4 血清非特异性免疫指标测定

溶菌酶活性、补体3、补体4含量采用合肥莱尔生物工程科技公司生产的试剂盒进行测定，测定步骤按照试剂盒说明书进行。碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、超氧化物歧化酶活性、谷草转氨酶活性和谷丙转氨酶活性采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定，测定步骤按照试剂盒说明书进行。

1.2.5 抗病力测定

将嗜水气单胞菌接种于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，28 ℃培养24 h后，用0.85%无菌生理盐水洗脱获得菌悬液。预试验确定半致死密度(LD50)为5×106cfu/mL。

养殖试验结束后，每处理随机选取美洲鳗鲡30尾，分为3组，每组10尾。每尾腹腔注射0.3 mL密度为5×106cfu/mL的嗜水气单胞菌，随后按此前的试验程序继续投喂饲养。每日记录死亡情况，捞出死鱼，攻毒试验持续14 d。按下式计算各组死亡率(RM，%)及相对免疫保护率(Rm，%)。

RM=(n1-n2)/n1×100%

(1)

Rm=(1-Re/Rb)×100%

(2)

式中，n1为攻毒前活鱼数量(尾)，n2为攻毒后活鱼数量(尾)，Re为试验组死亡率(%)，Rb为对照组死亡率(%)。

1.3 数据处理

试验数据用平均值±标准差表示，结果采用软件SPSS 19.0进行单因素方差分析，采用邓肯多重比较分析试验结果的差异显著性，P<0.05为差异显著。

2.1 蝇蛆蛋白混合物对美洲鳗鲡血清溶菌酶活性的影响

随着饲料中蝇蛆蛋白混合物添加量的增加，溶菌酶活性呈先升后降的趋势，各添加组溶菌酶活性均显著高于对照组(P<0.05)(表6)，其中以15%蝇蛆蛋白添加组的活性最高(158.31 U/L)，但与10%蝇蛆蛋白添加组差异不显著(P>0.05)，与5%和20%蝇蛆蛋白添加组差异显著(P<0.05)。

表6 饲料中添加蝇蛆蛋白混合物对美洲鳗鲡血清溶菌酶活性的影响(n=15) U/L

2.2 蝇蛆蛋白混合物对美洲鳗鲡血清补体3、补体4含量的影响

美洲鳗鲡补体3含量随着蝇蛆蛋白混合物添加比例的增加而逐渐提高，各添加组均显著高于对照组(P<0.05)(表7)，其中以15%蝇蛆蛋白添加组补体3含量最高(85.66 μg/mL)，但与10%和20%蝇蛆蛋白添加组差异不显著(P>0.05)，与5%蝇蛆蛋白添加组差异显著(P<0.05)。美洲鳗鲡补体4含量也随着蝇蛆蛋白混合物添加比例的增加而提高，并以20%蝇蛆蛋白添加组补体4含量最高(128.04 μg/mL)。方差分析结果显示，10%、15%和20%蝇蛆蛋白添加组补体4含量显著高于对照组(P<0.05)，而5%蝇蛆蛋白添加组与对照组差异不显著(P>0.05)。

表7 饲料中添加蝇蛆蛋白混合物对美洲鳗鲡血清补体3、补体4含量的影响(n=15) μg/mL

2.3 蝇蛆蛋白混合物对美洲鳗鲡血清中酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性的影响

酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性均随饲料中蝇蛆蛋白混合物添加数量的增加而呈先升后降的趋势。各添加组酸性磷酸酶活性均显著高于对照组(P<0.05)(表8)，其中以15%蝇蛆蛋白添加组酸性磷酸酶活性最高(3.00 U/L)，但与10%和20%蝇蛆蛋白添加组差异不显著(P>0.05)，与5%蝇蛆蛋白添加组差异显著(P<0.05)。碱性磷酸酶以10%蝇蛆蛋白添加组活性最高(4.12 U/L)，显著高于5%蝇蛆蛋白添加组和对照组(P<0.05)，与15%和20%蝇蛆蛋白添加组差异不显著(P>0.05)。

表8 饲料中添加蝇蛆蛋白混合物对美洲鳗鲡血清酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性的影响(n=15) U/L

2.4 蝇蛆蛋白混合物对美洲鳗鲡血清超氧化物歧化酶活性的影响

随着饲料中蝇蛆蛋白混合物添加数量的增加，超氧化物歧化酶活性呈先升后降的趋势，各添加组超氧化物歧化酶活性均显著高于对照组(P<0.05)(表9)，其中以15%蝇蛆蛋白添加组超氧化物歧化酶的活性最高(80.09 U/L)，且显著高于其他各添加组(P<0.05)。

表9 饲料中添加蝇蛆蛋白混合物对美洲鳗鲡血清超氧化物歧化酶活性的影响(n=15) U/L

2.5 蝇蛆蛋白混合物对美洲鳗鲡血清转氨酶活性的影响

随着美洲鳗鲡饲料中蝇蛆蛋白混合物添加量的增加，谷丙转氨酶活性呈先升后降的趋势(表10)，其中当蝇蛆蛋白添加水平达到20%时，谷丙转

表10 饲料中添加不同比例蝇蛆蛋白混合物对美洲鳗鲡血清转氨酶活性的影响(n=15) U/L

氨酶活性显著低于对照组(P<0.05)。谷草转氨酶活性则随饲料中蝇蛆蛋白混合物添加量的增加而逐渐下降，但只有当蝇蛆蛋白添加水平超过15%后，谷草转氨酶活性才显著低于对照组(P<0.05)。以上结果表明，在饲料中添加一定比例的蝇蛆蛋白混合物，可有效降低美洲鳗鲡血清转氨酶活性，对美洲鳗鲡肝脏具有良好保护作用。

2.6 蝇蛆蛋白混合物对美洲鳗鲡抗病力的影响

攻毒后各组死亡情况见表11。蝇蛆蛋白混合物提高了美洲鳗鲡的相对免疫保护率，且随蝇蛆蛋白混合物添加比例的增加呈先升后降的趋势，其中以15%蝇蛆蛋白添加组的相对免疫保护率最高，为54.54%。因此，选择在饲料中添加15%蝇蛆蛋白为美洲鳗鲡免疫保护作用的最佳添加量。

表11 饲料中添加蝇蛆蛋白混合物对美洲鳗鲡抗病力的影响(n=3)

3.1 蝇蛆蛋白混合物对美洲鳗鲡血清溶菌酶活性的影响

溶菌酶存在于鱼类的黏液、血清、吞噬细胞和单核细胞胞浆内，是生物体内重要的非特异性免疫因子之一，它能破坏细菌细胞壁结构，使细菌内容物溢出，从而杀死细菌，亦可诱导其他免疫因子的合成和分泌。因此，测定鱼体的溶菌酶活性，可在一定程度上反映鱼类非特异性体液免疫的状态，是鱼类非常重要的非特异性免疫评价指标之一。刘黎等[12-13]用蝇蛆粉添加到饲料中投喂青鱼(Mylopharyngodonpiceus)，结果表明，试验鱼血清中溶菌酶活性显著提高；
程逍妹等[5,7]用蝇蛆蛋白添加到饲料中投喂中华鳖(Pelodiscussinensis)和凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)，也证明试验材料血清溶菌酶活性显著提高；
吴锦辉等[26]在饲料中添加黑水虻(Hermetiaillucens)鲜虫提高了虎龙杂交斑(Epinephelusfuscoguttatus♀×E.lanceolatus♂)血清溶菌酶活性。张海琪等[6]报道，用蝇蛆蛋白粉替代中华鳖日本品系饲料中50%鱼粉，对中华鳖日本品系血清溶菌酶活性无显著影响；
陈乃松等[11]分别用3%和5%蝇蛆粉替代凡纳滨对虾饲料中的鱼粉，对虾血清溶菌酶活性反而下降。笔者在美洲鳗鲡饲料中添加蝇蛆蛋白混合物，溶菌酶活性随蝇蛆蛋白混合物添加量的增加呈先升后降的趋势，但各添加组溶菌酶活性均显著高于对照组(P<0.05)，且以15%蝇蛆蛋白添加组活性最高。本试验结果与程逍妹等[5,7,12-13,26]的研究结果基本一致，而与张海琪等[6,11]的结果不同。推测可能与应用方式有关，张海琪等[6,11]均采用蝇蛆粉等量替代鱼粉，由于蝇蛆粉的蛋白质含量为50%～55%，低于中华鳖及对虾饲料中使用的进口鱼粉蛋白含量，等量替代可能会使养殖动物因摄入蛋白数量减少而影响溶菌酶的活性。

饲料中添加适宜蝇蛆蛋白混合物能显著提高美洲鳗鲡血清中溶菌酶活性，可能与蝇蛆蛋白含有抗菌肽(或蛋白)、壳聚糖和凝集素等生命活性物质可提高美洲鳗鲡免疫性能有关。但添加量过多，导致饲料蛋白质含量过高，反而会加重动物机体代谢负担，抑制免疫活性的发挥，这可能是美洲鳗鲡随饲料中蝇蛆蛋白混合物添加数量增加，溶菌酶活性呈先升后降的原因。

3.2 蝇蛆蛋白混合物对美洲鳗鲡血清补体3、补体4含量的影响。

血清补体活性是重要的非特异性防御指标，可保护机体抵御病原菌的感染，而补体3、补体4是补体系统中的固有成分，参与补体的激活过程，因此具有调节动物机体非特异性免疫的功能。刘黎等[12]研究表明，在饲料中添加5%蝇蛆粉可显著提高青鱼鱼种血清中补体3、补体4的含量；
明建华等[13]也证明，在饲料添加2.5%蝇蛆粉显著提高了青鱼血清补体3、补体4含量；
赵峰[17]在黄鳝(Monopterusalbus)饲料中添加20%蝇蛆浆，黄鳝血清中补体3、补体4含量显著提高。本试验结果表明，美洲鳗鲡补体3、补体4含量均随饲料中蝇蛆蛋白混合物添加比例的增加而逐渐提高，且各添加组均显著高于对照组。本试验结果与刘黎等[12-13,17]的结果相似，但与宋宇琨等[22]的结果在补体4上不一致。宋宇琨等[22]研究发现，在黄羽肉鸡饲料中添加蝇蛆粉，血清中补体3随着蝇蛆粉用量的增加而增加，但补体4的含量各组间差异不显著。试验结果不一致可能与研究对象不同有关。

3.3 蝇蛆蛋白混合物对美洲鳗鲡血清中酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性的影响

酸性磷酸酶在生物体内直接参与磷酸基团的转移和代谢，间接增强机体非特异性免疫能力；
碱性磷酸酶则是生物体内一种重要的代谢调控酶，参与磷酸基团的转移和钙磷代谢，在鱼类对营养物质的吸收与利用过程中发挥着重要作用，此外碱性磷酸酶能够改变病原体的表面结构，从而增强机体对病原体的识别和吞噬能力。隋延鸣等[16]用蝇蛆浆投喂黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)仔鱼显著提高了仔鱼酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性；
程逍妹等[5,7]分别在凡纳滨对虾、中华鳖饲料中添加20%和15%蝇蛆蛋白，均显著提高了2种养殖动物血清中酸性磷酸酶及碱性磷酸酶活性；
张海琪等[6]用蝇蛆粉替代中华鳖饲料中50%的鱼粉，使中华鳖血清中酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性显著提高；
明建华等[13]用蝇蛆粉添加到饲料中投喂青鱼，试验鱼血清中碱性磷酸酶活性显著提高。本试验结果表明，酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性均随饲料中蝇蛆蛋白混合物添加数量的增加而呈先升后降的趋势，各添加组酸性磷酸酶活性均显著高于对照组，其中酸性磷酸酶以添加15%蝇蛆蛋白活性最大，碱性磷酸酶以添加10%蝇蛆蛋白活性最高。本试验结果与上述结果相似。刘丽波等[10]用鲜活蝇蛆等量替代人工配合饲料养殖凡纳滨对虾，发现不同替代组的酸性磷酸酶及碱性磷酸酶活性或与对照组差异不显著或低于对照组；
孟素宣等[15]用蝇蛆粉替代锦鲤(Cyprinuscarpiokoi)饲料中20%、40%、60%、80%和100%的鱼粉，各试验组碱性磷酸酶活性与对照组差异不显著。本试验结果与刘丽波等[10]的结果不一致，可能与其用鲜活蝇蛆等量替代人工配合饲料导致对虾摄食的蛋白质总量下降有关；
与孟素宣等[15]不一致，可能与鱼的种类不同有关。

王纤纤等[27]研究了饲料蛋白质水平对异齿裂腹鱼(Schizothoraxoconnori)非特异性免疫的影响，结果发现，随着饲料蛋白质水平的提高，肝脏酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性均呈先增后减的变化趋势，推测饲料中蛋白质水平过高可能会抑制酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性，给免疫系统带来负面影响。而本试验中的蝇蛆蛋白混合物是折算为干物质后进行添加，由于干品蝇蛆蛋白质含量通常约为55%，而美洲鳗鲡基础饲料蛋白质含量仅为44%，因此在美洲鳗鲡饲料中添加20%蝇蛆蛋白，可能导致饲料蛋白水平过高，从而降低血清中酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性，有关此问题尚需作进一步研究。

3.4 蝇蛆蛋白混合物对美洲鳗鲡血清超氧化物歧化酶活性的影响

有研究证明，家蝇幼虫及蛹中均含有丰富的抗氧化活性的肽类物质，可有效提高细胞抗氧化系统相关酶活性，降低活性氧自由基对细胞造成的氧化损伤[30-31]。笔者在美洲鳗鲡饲料中添加适量的蝇蛆蛋白混合物，美洲鳗鲡血清中超氧化物歧化酶活性显著提高，也证明了蝇蛆蛋白可增强美洲鳗鲡的抗氧化能力，至于蝇蛆蛋白添加量过多，超氧化物歧化酶活性反而下降，可能与饲料蛋白质水平过高有关。

3.5 蝇蛆蛋白混合物对美洲鳗鲡血清转氨酶活性的影响

转氨酶是反映肝脏功能的一项指标，当组织器官活动或病变时会将转氨酶释放到血液中，使血清转氨酶含量升高。一般认为，谷丙转氨酶活性增加，说明肝脏发生障碍；
而谷草转氨酶活性增加，则说明心脏发生障碍。因此，可根据血清中这两种转氨酶活性的变化来判断肝脏等组织器官的功能状况。曹俊明等[32]用蝇蛆粉分别替代凡纳滨对虾饲料中20%、40%、60%、80%和100%的鱼粉，各替代组凡纳滨对虾血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性随替代量增加呈降低趋势，其中100%替代组谷丙转氨酶活性和60%～100%替代组谷草转氨酶活性显著低于对照组；
刘黎等[12-13]在青鱼饲料中添加蝇蛆粉，青鱼血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶均与对照组差异不显著。本试验中，美洲鳗鲡血清中谷丙转氨酶活性随饲料中蝇蛆蛋白混合物添加量的增加呈先升后降的趋势，20%蝇蛆蛋白添加组的谷丙转氨酶活性显著低于对照组；
谷草转氨酶活性则随饲料中蝇蛆蛋白混合物添加量的增加而逐渐下降，添加水平超过15%后，谷草转氨酶活性才显著低于对照组。这说明在饲料中添加一定比例的蝇蛆蛋白混合物，可有效降低美洲鳗鲡血清转氨酶活性，对美洲鳗鲡肝脏具有良好保护作用。本试验结果与曹俊明等[32]的结果基本一致，与刘黎等[12-13]报道的不一致，可能与研究对象不同有关。

3.6 蝇蛆蛋白混合物对美洲鳗鲡抗病力的影响

攻毒感染方式是检验养殖动物抗病力和免疫功能的一种常用方法，可客观评价生物体对于外界病原菌的抵抗能力，直观反映机体免疫能力强弱。赵峰[17]用添加不同比例的蝇蛆浆饲料投喂黄鳝90 d后用嗜水气单胞菌攻毒，结果显示，各添加组相对免疫保护率均显著高于对照组，且相对保护率随蝇蛆浆添加量的增加呈先升后降的趋势，以添加20%蝇蛆浆的相对免疫保护率最大；
程逍妹等[5]用嗜水气单胞菌攻毒表明，摄食15%蝇蛆蛋白的中华鳖累积死亡率显著低于对照组，相对保护率为67.99%；
明建华等[13]采用嗜水气单胞菌攻毒发现，摄食含有蝇蛆粉饲料的青鱼存活率显著高于对照组；
陈乃松等[11]分别用含有蝇蛆粉和β-葡聚糖的饲料投喂凡纳滨对虾一段时间后，再用溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)进行攻毒，结果蝇蛆粉组和β-葡聚糖组的对虾抵抗力均显著高于对照组，且以蝇蛆粉组抵抗力最强；
笔者用嗜水气单胞菌攻毒美洲鳗鲡14 d后，累积死亡率随着饲料中蝇蛆蛋白混合物添加量的增加呈先降后升的趋势，而相对免疫保护率则呈先升后降的趋势。试验结果与上述所报道的结果基本一致。证明在饲料中添加适量的蝇蛆蛋白混合物投喂美洲鳗鲡，可增强美洲鳗鲡的非特异性免疫能力，进而提高其成活率，预防美洲鳗鲡疾病的发生；
同时也说明蝇蛆蛋白中含有的多种免疫活性物质如抗菌肽、壳聚糖、几丁质和凝集素等，可提高动物机体免疫力。

试验结果表明，在美洲鳗鲡饲料中添加蝇蛆蛋白混合物可有效提高美洲鳗鲡血清中免疫酶(溶菌酶、补体3、补体4、超氧化物歧化酶、酸性磷酸酶和碱性磷酸酶)活性，降低转氨酶(谷丙转氨酶和谷草转氨酶)活性，提高美洲鳗鲡非特异性免疫功能，从而增强美洲鳗鲡免疫力和抗病力。其中以在美洲鳗鲡饲料中添加15%蝇蛆蛋白的效果最佳。