基于高通量测序技术对不同季节圈养褐马鸡肠道菌群多样性分析

雷 英 苏 凯 王运盛 李金邦 张成林 李 雁 张丽霞 朱云芸 金修哲 任倩俐 刘金鹏 普天春*

(1.太原动物园，太原，030009；
2.北京动物园，北京，100044；
3.北京动物园圈养野生动物技术北京市重点实验室，北京，100044)

Seasonal variation

动物机体是许多微生物的永久性宿主，微生物大多在动物胃肠道定殖，对宿主的新陈代谢和健康发挥重要调节作用[1]。越来越多的研究表明，肠道微生物群不仅参与了分解、吸收和转化营养物质的过程，还是宿主抵御肠道病原微生物感染的天然屏障[2-3]，肠道菌群促进肠道的免疫应答，维持免疫稳态，防止病原体定殖，以此维持肠道健康[4]。肠道微生物种群之间关系有互利共生、偏利共生、拮抗和竞争等，种群结构始终处在一种动态平衡的过程中，一旦这种平衡关系被打破就会引发疾病[5]。

褐马鸡(Crossoptilonmantchuricum)是我国特有的珍稀鸟类，隶属于鸡形目(Galliformes)雉科(Phasianidae)马鸡属(Crossoptilon)，被列为国家一级保护动物[6]。多年来，随着我国圈养禽类人工免疫和驱虫工作的持续开展，传染性疾病和寄生虫疾病已经得到有效遏制[7-8]，但由于季节更替导致的消化道疾病，如腹泻、消化障碍、坏死性肠炎及溃疡性肠炎时有发生，临床上治疗难度较大，使用抗菌药物杀灭致病菌也会破坏消化道内正常的菌群结构，导致消化功能紊乱，免疫力降低[9]。

目前，对禽类肠道菌群的研究多集中在肉鸡、蛋鸡和雉科鸟类等[10-11]，在野生动物领域中，圈养褐马鸡的肠道菌群研究鲜见报道。本研究通过高通量测序技术对圈养褐马鸡肠道菌群进行多样性分析，对比不同季节肠道菌群结构的变化规律，预测潜在致病的高发时间段，为提高褐马鸡疾病防控能力和饲养管理水平提供理论依据。

1.1 材料

同等饲养条件下2.5～3.5岁的圈养褐马鸡30只，雌雄各15只，健康状态良好，分别于2021年1月(冬季)、4月(春季)、7月(夏季)和10月(秋季)的1日、15日和30日清晨用灭菌采样管随机采集新鲜粪便，样品全部采集完毕后分为4组，分别是春季组、夏季组、秋季组和冬季组，液氮中保存。

1.2 DNA提取和PCR反应

利用E.Z.N.A.®Stool DNA试剂盒(Omega，USA)提取4组褐马鸡粪便中微生物的总DNA，通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量，同时采用紫外分光光度计对DNA定量分析。PCR反应靶向扩增16S rDNA的V3—V4片段，PCR反应体系为Phusion®Hot start flex 2X MasterMix 12.5 μL，模板DNA 50 ng，上下游引物各2.5 μL，超纯水加至25.0 μL，经过95 ℃预变性30 s；
98 ℃变性10 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35个循环；
最后72 ℃延伸10 min完成PCR扩增。

1.3 产物纯化及文库构建

PCR产物经过纯化及定量构建文库。扩增子文库的大小和数量分别在Agilent 2100生物分析仪和Illumina的文库定量试剂盒上评估。

1.4 高通量测序和数据分析

全部样本测序完成后，将得到原始数据利用Overlap技术将双端数据拼接，进行质控、嵌合体过滤，获得高质量的干净数据(clean data)；
再通过“去重复”等步骤，获得单碱基精度的代表序列；
使用ASVs(扩增子序列变异)的概念构建类OTU表，获得最终的特征表及特征序列(Feature)；
最后在联川生物技术股份有限公司(LC-Bio)的生物分析平台进行多样性分析、物种分类注释和差异分析等。

2.1 样品测序有效数据统计

通过高质量数据统计，12份褐马鸡粪便共得到有效序列837 492条，序列长度为400～500 bp，特征序列为8 884个，褐马鸡粪便样品中冬季组的特征序列数量最高，夏季组最低；
重叠部分最高的是408个特征序列，最低为13个特征序列。4个组重叠部分为76个特征序列(图1)。

图1 不同季节褐马鸡粪便样品中特征序列数量分布Fig.1 Distribution of feature quantity in fecal samples of Crossoptilon mantchuricum at four seasons

2.2 Alpha多样性分析

Alpha多样性主要通过Chao1、Observed species、Goods coverage、Shannon和Simpson 5个指数反映丰富度和均匀性。本研究中，冬季组的Chao1指数最高，为1 577.5～1 770.0，丰富度最高；
夏季组的Chao1指数为419.8～513.0，丰富度最低。Observed species稀释曲线显示，被检出的特征序列数量由高到低依次是冬季组、秋季组、春季组、夏季组(图2)；
Shannon index稀释曲线显示，物种多样性排列由高到低依次是冬季组、春季组、秋季组、夏季组(图3)。Goods coverage是指微生物覆盖率，数值越高，则样本中新物种没有被测出的概率越低，本研究中各样本的Goods coverage指数均为1，印证了本次测序结果真实可靠。

图2 Observed species稀释曲线Fig.2 Dilution curve of observed species

图3 香农指数稀释曲线Fig.3 Dilution curve of Shannon index

2.3 Beta多样性分析

Beta多样性是指不同组别之间的物种差异性。Beta多样性与Alpha多样性一起构成了总体多样性或一定环境群落的生物异质性。通过主坐标分析(principal coordinates analysis，PCoA)观察样品组别之间的差异，结果中不同颜色代表不同分组，样品距离越近，说明样品之间的微生物组成结构越相似，反之则差异较大。冬季组与春季组、秋季组较为接近，夏季组与其他3组均距离较远，说明微生物菌群种类差异较大(图4)。

图4 PCoA分析Fig.4 Schematic diagram of PCoA analysis

非加权组平均法(unweighted pair group method with arithmetic mean，UPGMA)聚类分析也可以充分地佐证上述结果。图5中不同颜色分支代表不同的分组，聚类树展现了样本间的相似度，样本间的分枝长度越短，两样本越相似，反之则差异较大。

图5 UPGMA层次聚类分析Fig.5 UPGMA hierarchical cluster analysis

2.4 物种分析

特征序列是物种分类的原始文件，为了更加准确地分析物种组成，使用SILVA及NT-16S数据库做物种分类及后续分析。根据特征序列注释结果和各样品特征表，获得界、门、纲、目、科、属、种水平物种丰度表，并针对不同水平物种丰度表对4组样品的肠道菌群进行物种组成及组间差异的分析，本研究重点关注门和属水平上的变化。

2.4.1 门和属水平上的物种分析

根据物种丰度表和物种注释表，默认选取门和属水平上丰度最高的30个物种分类，将各组的物种相对丰度堆叠柱状图形式展示(图6，图7)。

图6 褐马鸡各组肠道菌群在门水平上的物种相对丰度Fig.6 Relative species abundance of intestinal flora in each group of Crossoptilon mantchuricum at the phylum level

图7 褐马鸡各组肠道菌群在属水平上的物种相对丰度Fig.7 Relative species abundance of intestinal microflora in each group of Crossoptilon mantchuricum at the genus level

在门水平上，圈养褐马鸡的优势菌群为厚壁菌门(Firmicutes，52.11%)、拟杆菌门(Bacteroidetes，18.20%)、变形菌门(Proteobacteria，17.91%)和放线菌门(Actinobacteria，7.32%)，其中，厚壁菌门在春季组丰度最高(64.25%)，冬季组最低(40.39%)；
拟杆菌门在冬季组最高(36.72%)，夏季组最低(5.63%)；
变形菌门在夏季组最高(34.81%)，春季组最低(3.61%)；
放线菌门在春季组最高(15.39%)，夏季组最低(1.42%)。

在属水平上，Rikenellaceae_RC9_gut_group为优势菌属(5.56%)，其次是链球菌属(Streptococcus，5.47%)和脱硫弧菌属(Desulfovibrio，4.74%)。链球菌属在夏季组丰度最高(21.84%)，远远高于其他组，提示夏季消化系统疾病风险可能极大增加；
脱硫弧菌属在秋季组最低(8.77%)。值得关注的是，赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus)在夏季组最高(3.84%)，而在春季组和冬季组最低(<0.01%)；
作为益生菌的类芽孢杆菌属(Paenibacillus)亦是如此，在夏季组占3.19%，其他组小于0.74%。

2.4.2 季节变化规律

圈养褐马鸡肠道菌群在门水平上的变化规律以春、夏、秋、冬四季依次排序，厚壁菌门呈递减趋势，春季组丰度最高(64.25%)，冬季组最低(40.39%)；
拟杆菌门在春季组和夏季组较低，秋季组和冬季组呈递增趋势，冬季组丰度接近40%；
变形菌门在夏季组丰度最高，差异显著(P<0.05)；
放线菌门整体丰度较低，春季组相对较高(15.39%)，其他各组均低于7%(图8)。

图8 褐马鸡肠道门水平优势菌群的季节变化规律Fig.8 Seasonal variation of dominant intestinal flora of Crossoptilon mantchuricum at the phylum level

在属水平上，Rikenellaceae_RC9_gut_group最为优势，春季组至夏季组呈递减趋势，秋、冬组逐渐升高，冬季组达到峰值，差异显著(P<0.05)；
链球菌属在夏季呈爆发式增长，其他各组均低于0.05%；
脱硫弧菌属由春季组过渡至夏季组呈下降趋势，随后至秋季组丰度最高，最后到冬季组略微下降(图9)。

图9 褐马鸡肠道属水平优势菌群的季节变化规律Fig.9 Seasonal variation of dominant intestinal flora of Crossoptilon mantchuricum at the genus level

2.4.3 物种种群之间的关系

在微生态研究中，通过不同物种在各样品中的丰度及变化关系，计算物种之间的相关性，通过一定条件的筛选，找到不同微生物类群间的相互关系(正相关或负相关)。SparCC分析是通过计算属水平丰度top30的微生物丰度，获得两两优势菌群之间的相关性以及显著性P值，绘制出相关性热图[12]。从图10中可以看出，Rikenellaceae_RC9_gut_group与粪杆菌属(Faecalibacterium)、脱硫弧菌属和拟杆菌属(Bacteroides)呈正相关性，而同链球菌属、赖氨酸芽孢杆菌属和类芽孢杆菌属呈负相关性；
链球菌属和脱硫弧菌属、粪杆菌属呈负相关性，同赖氨酸芽孢杆菌属和类芽孢杆菌属则呈正相关性，这也从另一个角度印证了链球菌属、赖氨酸芽孢杆菌属和类芽孢杆菌属在夏季组的相对丰度高于其他3组的检测结果。

图10 褐马鸡肠道菌群SparCC热图Fig.10 SparCC network heatmap of intestinal flora of Crossoptilon mantchuricum

2.4.4 潜在致病性预测

通过BugBase对4组褐马鸡肠道菌群进行潜在致病性预测，再对应之前分析得出的菌群差异，可以有效地从源头对疾病预防及治疗[13]。图11显示：夏季组的潜在致病性显著高于其他组(P<0.05)，从夏季组丰度较高的种群中筛选出相关致病菌，为临床预防及治疗提供理论依据。对比上述结果，推测链球菌属是导致夏季组潜在致病性明显增高的因素之一。

图11 褐马鸡潜在致病性预测Fig.11 Prediction of potential pathogenicity of Crossoptilon mantchuricum

在动物个体健康状态良好的条件下，肠道菌群的变化是个稳定且缓慢的过程，对同等饲养条件下3岁左右的圈养褐马鸡，分别于2021年1月(冬季)、4月(春季)、7月(夏季)和10月(秋季)的1日、15日和30日随机采集新鲜粪便，试验全程未使用任何药物或益生菌干预，目的在于将时间间隔拉开，以便发现并研究不同季节的肠道微生物差异，同时在每个组内连续采样3次，将组内的差异性降低，使结果更加客观、科学和有效。

沈佳斌等[11]研究雉科鸟类肠道菌群组成后发现，在门水平上，含量最高的是变形菌门(54.66%)，其次是厚壁菌门(24.02%)和拟杆菌门(12.07%)，本研究结果显示：圈养褐马鸡的肠道菌群中厚壁菌门(52.11%)最为优势，其次是拟杆菌门(18.20%)、变形菌门(17.91%)。拟杆菌门对纤维素以外的其他物质的降解效果显著[14]，而厚壁菌门的重要作用是分解纤维素类物质[15]。本研究厚壁菌门的丰度最高，这与圈养褐马鸡的饲养环境较为固定，以及饲料结构中包含大量植物纤维素有关。在属水平上，4组中最为优势菌均为Rikenellaceae_RC9_gut_group、链球菌属和脱硫弧菌属。

通过Alpha多样性分析和潜在致病性预测，夏季组的肠道菌群丰富度最低，但潜在致病性最高，这点通过SparCC分析结果可以说明，链球菌属在夏季组丰度最高，但是链球菌属和Rikenellaceae_RC9_gut_group、脱硫弧菌属、Ruminococcaceae_UCG-005、粪杆菌属、拟杆菌属等几种相对丰度较高的菌种呈负相关关系，从微生物与环境的关系来讲，链球菌属与这些菌属属于偏害共生关系，其代谢产物改变了肠道中的环境条件，从而抑制其他微生物的生长繁殖。但同时，在夏季组，同属于益生菌的赖氨酸芽孢杆菌属和类芽孢杆菌属含量最高，与链球菌属呈正相关关系，说明机体始终处于一种自我调节的动态平衡中，当条件致病菌处于优势时，劣势菌种会启动“竞争”机制，以“努力”维持机体健康的内环境。微环境改变越明显，竞争越激烈[16]，这样才能维持机体能量转化和新陈代谢的正常需求。