黑皮鸡枞菌多糖提取工艺及抗氧化活性研究

陈灼娟，周倩，杨志强

(1.福州大学至诚学院 食品与生物工程系，福州 350102；
2.福建省食品药品质量检验研究院，福州 350011)

真菌多糖是从真菌中分离出来的由10个分子以上单糖通过糖苷键连接的高分子聚合物。真菌多糖具有抗氧化[1]、抗肿瘤[2]、提高免疫力[3]、调节血糖[4]、抗病毒[5]、抑菌[6]等生物活性。目前已有上百种真菌多糖被分离并研制成调味品、药品或保健品。真菌多糖可以制成丸剂、汤剂、针剂、冲剂、片剂、胶囊、糖浆乃至饮品、速溶茶、酒饮料等产品。真菌多糖产品具有广阔的开发前景。

黑皮鸡枞菌是一种药食两用的珍贵食用菌，其多糖含量高于一般食用菌[7-9]，是一种良好的提取材料。食用菌多糖提取有水提法、酸碱浸提法、酶解法、超声波法、超临界流体萃取法、微波法等[10]。其中酶解法具有条件温和、易控制、时间短、提取率高以及对多糖结构损害较小等优点[11]。采用纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶组成复合酶，去除纤维素、蛋白质及果胶等成分，利于多糖溶出[12]，辅助超声波技术，促进物质的扩散和溶解，增强提取效果[13-14]。采用超声波辅助复合酶提取黑皮鸡枞菌多糖，优化多糖提取工艺，并对提取物的抗氧化活性进行测定，可以为黑皮鸡枞菌多糖产品的开发和利用提供参考。

1.1 材料

黑皮鸡枞菌干品：产于云南。

1.2 试剂

硫酸、苯酚、无水乙醇、七水合硫酸亚铁、氢氧化钠、过氧化氢：均为分析纯，西陇科学股份有限公司；
抗坏血酸(分析纯)：天津市北辰区方正试剂厂；
水杨酸(分析纯)：天津博迪化工股份有限公司；
DPPH(分析纯)：上海麦克林化工有限公司；
纤维素酶(10 U/mg)：生物纯，罗恩试剂；
果胶酶(500 U/mg)、木瓜蛋白酶(800 U/mg)：均为生物纯，上海源叶生物科技有限公司。

1.3 主要仪器与设备

UV-5200紫外分光光度仪 上海元析仪器有限公司；
3K15台式冷冻离心机 德国西格玛公司；
DK-S26恒温水浴锅 上海森信实验仪器有限公司；
FE28 Standard酸度计 美国梅特勒-托利多仪器有限公司；
RE-52AA旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；
SHZ-(Ⅲ)循环水式真空泵 巩义市予华仪器有限责任公司；
KQ5200DE台式超声波清洗机 昆山市超声仪器有限公司。

1.4 试验方法

1.4.1 多糖提取的工艺流程

将黑皮鸡枞菌子实体干燥至恒重，用粉碎机粉碎后过40目筛备用。精确称取1.00 g黑皮鸡枞菌子实体粉末置于三角瓶中，加入30 mL超纯水搅拌均匀，于90 ℃水浴中浸胀1 h，温度迅速降至室温，制成黑皮鸡枞菌粉溶液。称取质量分数为2%的复合酶，加入黑皮鸡枞菌粉溶液，在50 ℃、pH 5.5的条件下，酶解120 min。酶解结束后，将酶解液pH调节至7，迅速升温至90 ℃灭酶10 min。将上述酶解液置于超声波仪中，在60 W、50 ℃条件下，超声处理20 min。酶解液离心取上清液，加入4倍体积无水乙醇沉淀静置过夜，在5 000 r/min条件下，离心10 min，取沉淀，沉淀用无水乙醇洗涤2次，干燥后得黑皮鸡枞菌粗多糖。

1.4.2 多糖提取率的计算

黑皮鸡枞菌粗多糖用蒸馏水溶解，利用苯酚硫酸法测定多糖含量[15]，计算多糖的提取率。以葡萄糖含量Y(μg)为纵坐标，吸光值A为横坐标，绘制葡萄糖标准曲线，得线性方程Y=123.19A，相关系数R2=0.998。取2.0 mL黑皮鸡枞菌多糖溶液进行适当稀释，用相同方法显色测吸光值A，代入方程计算多糖含量，求出多糖提取率。

1.4.3 多糖提取单因素试验

按照“1.4.1”提取黑皮鸡枞菌多糖。固定其他因素，分别以酶的比例(纤维素酶∶果胶酶∶木瓜蛋白酶为1∶4∶5、3∶2∶5、4∶2∶4、4∶3∶3、8∶1∶1)、酶的添加量(1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%)、液料比(10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1)、pH(4.5，5.5，6.5，7.5，8.5)、酶解温度(30，40，50，60，70 ℃)和酶解时间(30，60，90，120，150 min)为单因素，考察这些因素对黑皮鸡枞菌多糖提取率的影响，试验重复3次，试验结果取平均值。

1.4.4 多糖提取响应面试验

在单因素试验的基础上，选择液料比、酶解温度和酶解时间3个因素，采用Design-Expert 8.0.5 软件设计三因素三水平的BBD试验[16]，试验因素与水平设计见表1，以多糖提取率为指标，确定最优的提取条件，在实际条件下进行验证试验。

表1 Box-Behnken 试验设计因素与水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken test design

1.4.5 黑皮鸡枞菌多糖的抗氧化活性分析

1.4.5.1 DPPH自由基清除能力测定[17]

配制0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 mg/mL的黑皮鸡枞菌多糖溶液与0.02 mmol/L DPPH-乙醇溶液。2.0 mL不同浓度的多糖溶液分别与2.0 mL DPPH-乙醇溶液充分混合后，避光反应30 min，测定517 nm处的吸光值A1。用相同体积无水乙醇替代DPPH-乙醇溶液，测定吸光值A2。用相同体积超纯水替代多糖溶液，测定吸光值A0。DPPH自由基清除率按照公式(1)计算。同时以相同方法测定不同浓度的抗坏血酸(VC)的自由基清除率，作为阳性对照。试验重复3次，取平均值作为最终的试验结果。

(1)

1.4.5.2 羟自由基清除能力测定[18]

配制0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 mg/mL的黑皮鸡枞菌多糖溶液、9 mmol/L FeSO4溶液、9 mmol/L乙醇-水杨酸溶液、8.8 mmol/L H2O2溶液。准确量取FeSO4溶液、乙醇-水杨酸溶液、多糖溶液各1.0 mL，混合均匀后，加入1.0 mL H2O2溶液，在37 ℃水浴中反应15 min，测定510 nm处的吸光值A1。用蒸馏水代替H2O2，测吸光值A2。用蒸馏水代替多糖溶液，测吸光值A0。同时以相同方法测定不同浓度的抗坏血酸(VC)的自由基清除率，作为阳性对照。试验重复3次，取平均值作为最终的试验结果。

(2)

2.1 多糖提取试验优化

2.1.1 多糖提取单因素试验结果及分析

2.1.1.1 复合酶比例对多糖提取率的影响

纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶按一定质量比(1∶4∶5、3∶2∶5、4∶2∶4、4∶3∶3、8∶1∶1)加入黑皮鸡枞菌粉溶液，按照“1.4.1”的方法进行酶解，研究不同复合酶比例对多糖提取率的影响。由图1可知，不同复合酶比例下提取效果差异较大。子实体多糖存在于细胞壁内，复合酶能使与多糖结合的纤维素、果胶、蛋白质等不同程度分离溶出。增加纤维素酶的比例，可使多糖提取率显著增加，当纤维素在复合酶中的比例为40%时，提取率较高，再增加纤维素酶的比例至80%，提取率大大降低。当纤维素酶占比为40%时，果胶酶∶木瓜蛋白酶为1∶1时，多糖提取率最高。综合试验结果，选择纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶的比例为4∶3∶3进行后续试验。

图1 复合酶比例对多糖提取率的影响Fig.1 Effect of complex enzyme ratio on the extraction rate of polysaccharides

2.1.1.2 液料比对多糖提取率的影响

不同液料比条件下多糖提取率见图2，经单因素方差分析，得到液料比对多糖提取率有极显著影响(P<0.001)。液料比由10∶1梯度增加到40∶1时，多糖提取率从5.33%逐步增加到13.29%，继续升高液料比至50∶1，多糖提取率下降。增加液料比，可以促进多糖的溶出，提高提取率[19]。但液料比过高，底物浓度下降，酶解效果降低，同时溶液过稀，稀释了超声波对物料的空化作用，导致多糖提取率下降[20]，液体使用量过多，也会增加后期纯化成本[21]。因此，选择液料比30∶1、40∶1、50∶1进行后续响应面优化分析。

图2 液料比对多糖提取率的影响Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on the extraction rate of polysaccharides

2.1.1.3 复合酶添加量对多糖提取率的影响

由图3可知，复合酶添加量从1.0%增加到2.5%时，多糖提取率从11.26%增加到16.71%，这是因为随着复合酶的增多，食用菌细胞壁发生了降解，有利于多糖溶出[22]。酶添加量继续增加至3.0%时，多糖提取率略有升高，但增幅不明显。酶的使用量在一定程度上决定了酶解时间和提取率，加入的酶太少，底物无法充分酶解。当酶量充足时，增加酶量对提取率的影响不大，综合试验成本考虑，选择3.0%的复合酶添加量，酶添加量因素不进行后续的响应面优化分析。

图3 复合酶添加量对多糖提取率的影响Fig.3 Effect of complex enzyme addition amount on the extraction rate of polysaccharides

2.1.1.4 酶解温度对多糖提取率的影响

由图4可知，酶解温度由30 ℃上升到60 ℃时，多糖提取率从9.79%增加至15.16%，达到最大值。随后酶解温度继续提高，多糖提取率出现下降趋势。酶解温度是复合酶提取法中较为重要的一个因素，在一定的适宜温度内，酶解温度既能影响酶的活力，也会影响物质的溶解度[23]，温度太高可能导致酶活力下降[24]，同时破坏多糖原有的活性和结构，而使酶解效率和酶解速率降低[25]。经单因素方差分析，得到酶解温度对多糖提取率有极显著影响(P<0.001)。因此，选择50，60，70 ℃进行后续的响应面优化分析。

图4 酶解温度对多糖提取率的影响Fig.4 Effect of enzymolysis temperature on the extraction rate of polysaccharides

2.1.1.5 酶解pH对多糖提取率的影响

由图5可知，不同酶解pH下的多糖提取率在13.58%～14.58%范围内，变化不大。酶解pH是酶解反应中重要的影响因素之一，不同的酶最适pH有所不同，pH过高或者过低都会影响酶的活性，同时影响多糖的溶出效应[26]。本研究试验结果显示，pH对酶解提取率的影响不大，可能是由于复合酶中的纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶的最适pH不同，在不同pH条件下此消彼长。经单因素方差分析，得到酶解pH对多糖提取率的影响不显著(P>0.05)。综合提取率和试验成本考虑，选择pH 7.5作为酶解条件，pH因素不进行后续的响应面优化分析。

图5 酶解pH对多糖提取率的影响Fig.5 Effect of enzymolysis pH on the extraction rate of polysaccharides

2.1.1.6 酶解时间对多糖提取率的影响

由图6可知，酶解时间从30 min增加到90 min，多糖提取率缓慢升高到最大值16.22%，继续延长酶解时间至150 min，多糖提取率下降。经单因素方差分析，得到酶解时间对多糖提取率有极显著的影响(P<0.001)。酶解时间过短，导致酶解反应不够充分，使得多糖不能有效浸提，而时间过长又会因为多糖可能水解，导致提取率下降[27]。综合考虑，选择酶解时间60，90，120 min进行后续的响应面优化分析。

图6 酶解时间对多糖提取率的影响Fig.6 Effect of enzymolysis time on the extraction rate of polysaccharides

2.1.2 响应面分析及优化

响应面试验方案及结果见表2。

表2 Box-Behnken试验设计及结果

续 表

利用Design-Expert 8.0.5对表2中的试验数据进行多项拟合回归分析，得到黑皮鸡枞菌多糖提取率Y(%)对液料比A(mL/g)、酶解温度B(℃)、酶解时间C(min)的二次项多元回归方程：Y(%)=-88.54+1.51A+2.19B+0.34C-9.75×10-4AB-2.02×10-3AC+1.26×10-3BC-1.49×10-2A2-2.14×10-2B2-2.11×10-3C2。

由表3方差分析结果可知，该模型的P<0.01，说明模型极显著，失拟项不显著，校正模型R2=0.945 4，RAdj2=0.875 3，说明模型与实际结果拟合较好。液料比(A)、酶解温度(B)、酶解时间(C)对多糖提取率的影响极显著。由F值可知，3个因素对多糖提取率影响的主次顺序为温度(B)>液料比(A)>酶解时间(C)。表3中交互项AB、BC及AC的P值均大于0.05，图7中两因素交互作用的响应面底部等高线接近圆形，说明这3个因素的交互作用不显著。

表3 响应面设计回归模型方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model of Box-Behnken design

图7 因素交互作用的响应面图Fig.7 Response surface diagrams of interactive effects of factors

2.1.3 提取参数及验证试验

采用Design-Expert 8.0.5软件分析，得到黑皮鸡枞菌多糖提取的最佳工艺条件为液料比47.50∶1(mL/g)、酶解温度54.24 ℃、酶解时间73.51 min，在该条件下预测提取率为19.14%。根据实际情况调整最佳提取工艺为液料比47∶1(mL/g)、酶解温度54 ℃、酶解时间73 min，在此条件下进行3次重复性验证试验，得到多糖提取率3次平均值为18.75%，相对误差为2.08%，实测值与预测值拟合度较好。

2.2 黑皮鸡枞菌多糖的抗氧化活性分析

2.2.1 DPPH自由基清除能力

以相同浓度的VC溶液为阳性对照，黑皮鸡枞菌多糖的DPPH自由基清除能力测定结果见图8。

图8 黑皮鸡枞菌多糖的DPPH自由基清除能力Fig.8 DPPH free radical scavenging ability of Oudemansiella raphanipies polysaccharides

由图8可知，黑皮鸡枞菌多糖样品溶液浓度在0.5～4.0 mg/mL范围内，DPPH自由基清除率随多糖样品溶液浓度的增加而升高。当黑皮鸡枞菌多糖溶液浓度为4.0 mg/mL时，黑皮鸡枞菌多糖自由基清除率为93.44%，表现出较强的自由基清除能力。

2.2.2 水杨酸法测羟基自由基清除率

以相同浓度的VC为阳性对照，黑皮鸡枞菌多糖的体外羟基自由基清除率测定结果见图9。

图9 黑皮鸡枞菌多糖的羟基自由基清除能力Fig.9 Hydroxyl free radical scavenging ability of Oudemansiella raphanipies polysaccharides

由图9可知，当黑皮鸡枞菌多糖样品溶液浓度由0.5 mg/mL增加至4.0 mg/mL时，多糖的清除率缓慢上升，具有较好的线性关系。当多糖浓度为4.0 mg/mL时，羟基自由基清除率为47.58%，与相同浓度的VC相比清除能力稍差。

单因素试验结合响应面试验得到黑皮鸡枞菌多糖的最佳提取条件为纤维素酶∶木瓜蛋白酶∶果胶酶4∶3∶3、复合酶添加量3.0 %、液料比47∶1(mL/g)、酶解温度54 ℃、酶解时间73 min、酶解pH 7.5，在该条件下，多糖的提取率达到18.75%，优于常见的水提法、醇提法。测定黑皮鸡枞菌多糖的DPPH自由基清除率及羟基自由基清除率，结果表明4.0 mg/mL 的黑皮鸡枞菌多糖对DPPH自由基清除率为93.44%，对羟基自由基清除率为47.58%，且自由基清除能力与浓度呈明显的效应关系，说明超声波辅助复合酶提取法能够保留黑皮鸡枞菌多糖的抗氧化活性。该方法提取的黑皮鸡枞菌多糖可以作为天然抗氧化剂，应用于食品、药物、保健品等领域。真菌多糖具有毒副作用小、药理作用多样等特点[28]，特别是在抗氧化方面，后期可以对其体内抗氧化活性进行研究，为其进一步开发利用提供理论依据。该方法提取的黑皮鸡枞菌多糖是否具有抗炎、抗癌、抗病毒、抗菌等生物学活性有待进一步研究。

真菌多糖最常见的提取方法为水提法，其原理是利用多糖易溶于水的特性进行提取，方法操作简单，但是耗时长且提取率不高，若在较高温度下反复操作，会降低多糖结构的稳定性[29]。本研究利用纤维酶、果胶酶及蛋白酶共同作用于黑皮鸡枞菌子实体细胞壁，减少传质阻力，操作简单，条件温和，不破坏多糖结构，辅助超声波提取技术，利用超声波的空化作用、机械振动、乳化效应等，加速多糖溶出，使多糖提取率高于常见的提取方法，该方法对今后的试验研究具有一定的借鉴作用。