周丽玲 李 艳
江苏省徐州市红十字血液中心 221006
胎儿与新生儿溶血病(Hemolytic Disease of the Fetus and Newborns,HDFN)是因胎母红细胞血型不合而引发的严重疾病。迄今为止，ABO、Rh血型不合引起的 HDFN最为常见。如果Rh(D)阴性妇女初次妊娠Rh阳性胎儿，有1/6的可能产生初次免疫，如果再次妊娠Rh阳性胎儿就有可能发生HDFN，其临床症状主要表现为胎儿或新生儿水肿、贫血、核黄疸甚至死亡[1]。大部分学者认为，造成HDFN的抗D效价临界值为16，若孕妇抗D效价≥16时，则提示胎儿、新生儿可能发生严重HDFN，需采取适当措施控制病情进展，若孕妇抗D效价<16时，发生HDFN可能性很低[2]。对Rh(D)阴性孕妇进行血型抗原及意外抗体的初步筛查、抗体特异性鉴定和抗体效价检测，跟踪监测抗D效价的变化，可为抗D引起的HDFN的及时治疗提供临床实验证据。本文通过对初筛为Rh(D)阴性孕妇妊娠史进行分类，研究妊娠史对抗D同种免疫的影响，以期为Rh(D)阴性孕妇产前监测指导提供更充足的理论依据。
1.1 研究对象 选取2010年5月—2021年10月在本实验室进行抗体筛查检测的Rh初筛阴性孕妇为研究对象，共计1 355例，去除重复检测、无孕产史、注射免疫球蛋白及有输血史孕妇，共计719例。最低年龄18岁，最高年龄44岁，中位数31岁。
1.2 主要试剂和仪器 抗D(IgM) 单克隆抗体(上海血液生物);3种IgG / IgM 混合型单克隆抗-D 试剂分别来自英国Millpore，加拿大Dominion，北京金豪;抗C(上海血液生物);抗c(上海血液生物);抗E(上海血液生物);抗e(上海血液生物);抗体筛选细胞(上海血液生物);谱细胞(上海血液生物);抗IgG,C3d(上海血液生物);血清学专用离心机(久保田，型号:KA-2200);37℃恒温水浴箱(上海比朗，型号:HH-600)。所有试剂均在有效期内。
1.3 RhD表型鉴定 (试管法) Rh血型初筛采用IgM 抗D检测红细胞表面D抗原，检测结果为阴性的判定为Rh(D)初筛阴性；
初筛为Rh(D)阴性的标本，用抗人球蛋白实验进行Rh(D)阴性确认。用至少3种不同来源或批次的单克隆IgG抗-D血清分别与受血者红细胞进行间接抗人球蛋白试验(试管法)。对于3管间接抗人球蛋白试验均为阴性的结果，判定为Rh(D)阴性。试管盐水介质法对Rh(D)阴性进行RhCE分型检测。
1.4 抗体筛查、鉴定 对Rh(D)初筛阴性标本，使用筛选细胞1#、2#、3#进行间接抗人球蛋白实验(IAT)检测血清(浆)中的意外抗体。对IAT阳性的标本，进一步使用谱细胞鉴定抗体特异性。具体实验操作按照操作规程[3]和试剂操作说明书进行。
1.5 抗D抗体效价测定 取50μl待检血清，进行倍比稀释，再每管加入浓度为3%的DccEE红细胞，37℃孵育30min后，用生理盐水洗涤3遍后，弃上清，加入抗IgG,C3d后，3 400r/min离心15s后看结果，以出现肉眼可见红细胞凝集±最高稀释度的倒数为抗D效价。
1.6 统计学方法 应用SPSS26.0统计分析软件处理数据，分类变量资料采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 抗体筛查与鉴定 对719例初筛Rh(D)阴性孕妇进行抗体筛查，其中检出IgG型抗D共28例，其中2例合并抗C；
IgG型抗E共1例；
IgM型抗M共3例；
未鉴定出特异性的低效价冷抗体共1例，其余抗体筛查结果均为阴性。详见表1。
表1 初筛Rh(D)阴性孕妇产前抗体筛查结果
2.2 妊娠史与抗D同种免疫的相关性分析 719例初筛Rh(D)阴性孕妇中，怀孕史1～7次，生产史1～2次，以妊娠次数分为4组。G1P0和G1P1为孕1次组，共计177例，抗D阳性 0例；
G2P0、G2P1和G2P2为孕2次组，共计284例，抗D阳性8例，阳性率2.82%；
G3P0、G3P1和G3P2为孕3次组，共计156例，抗D阳性7例，阳性率4.49%；
怀孕4次以上均归为孕4次及以上组，共计102例，抗D阳性13例，阳性率12.7%。随着妊娠次数的增加，抗D的阳性率相应的上升。孕2次、孕3次、孕4次组分别与孕1次组进行统计分析，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表2。(G:怀孕，P:生产，G1P0表示：孕1产0)
表2 Rh(D)阴性个体妊娠史与抗D同种免疫相关性分析
2.3 妊娠史与抗D效价的相关性分析 分别对孕2次组、孕3次组及孕4次及以上组的效价进行统计分析。对同一孕次在不同阶段检测的效价，以最后一次检测为准。其中5例在统计时间段里有2次妊娠史，按每次妊娠独立统计效价，共计33例。将效价分为<16和≥16两组孕3次、孕4次组分别与孕2次组进行统计分析，均无统计学差异(P>0.05)。详见表3。
表3 妊娠史与抗体效价的相关性比较
Rh血型系统与临床密切相关且意义重大的有 D 、 C 、c 、 E 、 e 5 个抗原，其中，D抗原免疫原性最强。当被D抗原致敏的Rh(D)阴性孕妇妊娠Rh(D)阳性胎儿时，胎儿红细胞经过胎盘渗入母体血液系统，刺激母体产生IgG性质抗D；
后者通过胎盘进入胎儿血液系统，与胎儿红细胞膜上的D抗原结合，使胎儿红细胞发生溶血，引起HDFN。
产生抗D抗体是Rh(D)阴性孕妇发生HDFN的先兆。本研究共筛查1 355例Rh(D)阴性孕妇，去除注射免疫球蛋白、有输血史、无孕产史及重复检测个体，共计719例，检出IgG型抗体29例，均属于Rh血型系统，其中抗D 28例，2例合并抗C，1例抗E。本地区Rh(D)阴性孕产妇抗D同种免疫的比例为3.89%(28/719)，与南京地区报道的4.14%相近[4]，远低于山东地区报道的9.54%[5]。笔者推测原因为：(1)山东地区的研究未将有输血史的Rh(D)阴性孕产妇剔除，有一部分Rh(D)阴性孕产妇是由于输血引起的抗D同种免疫，导致该地区孕产妇抗D同种免疫发生率高；
(2)可能与地区间DEL血型的占比有关。DEL是一种极弱的D抗原表达型，其弱D抗原只能通过吸收放散试验才可检出，目前常规定型无法将DEL型与真正Rh(D)阴性区分开来 。研究表明，“亚洲型”DEL血型个体红细胞表面具有完整的D抗原表位，该抗原表位的存在可以使机体不会因外源性D抗原刺激而发生抗D同种免疫[6]。是否是由于本地区“亚洲型”DEL血型较山东地区高，导致Rh(D)阴性抗D同种免疫发生率低，还有待进一步研究。
本研究1例Rh(D)阴性孕产妇检出抗E，而未检出抗D，其ABO血型为AB型，Rh分型为Ccee，孕4产1，胎儿父亲的血型为O型Rh(D)阳性。笔者推测胎儿父亲Rh分型含有E抗原，胎儿从父亲那遗传了E抗原，刺激胎母产生抗E抗体。E抗原的免疫原性较D抗原的低，推测这例Rh(D)阴性孕妇含有用常规方法检测不出的完整的D抗原表位，即为“亚洲型”DEL型。是否为“亚洲型”DEL型还需要进一步进行基因分型检测。
有文献报道，自然状态下，Rh(D)阴性孕妇的抗D同种免疫往往发生于第2胎及以后，这是因为在第1次妊娠时，胎儿红细胞上的D抗原渗入母体的红细胞造成母体初次免疫，下一次妊娠时，再次渗入母体的胎儿红细胞上的D抗原会刺激母体免疫系统的回忆反应，从而产生抗D[7]。本研究以不同的妊娠次数对719例标本分为4组，若孕产妇不同孕次均有检出抗D，则以首次产生抗D的孕次为准。孕1次包括孕1和孕1产1，均无抗D同种免疫发生，进一步说明抗D引起的HDFN不会发生在第1胎。随着妊娠次数的增加，即Rh(D)阴性个体接受D抗原刺激次数增加，发生抗D同种免疫的概率逐渐增大。本研究将妊娠2次以上的Rh(D)阴性孕产妇分为三组对抗D同种免疫的发生率进行统计，发现孕2次、孕3次及孕4次以上抗D同种免疫的发生率分布为2.82%、4.49%、12.7%。其中有1例产生抗D的Rh(D)阴性孕妇，其妊娠史为孕3产0，提示即使无生产史，多次流产史也能刺激Rh(D)阴性孕妇发生抗D同种免疫。
定期监测效价是目前临床常用于Rh(D)阴性血型孕妇孕期管理的检测方法之一。本研究表明孕妇的妊娠次数与抗D效价高低并无明显关联性，原因可能是抗D效价的增长与Rh(D)阴性孕妇胎母出血量、母体免疫应答能力等因素有关。但抗D效价高低致使HDFN发生风险及溶血程度，则有待进一步研究。
抗D抗体能引起严重的HDFN。为了降低抗D导致的HDFN的发生率，一方面，Rh(D)阴性孕产妇要减少流产的次数，以避免妊娠次数的增加导致抗D同种免疫的发生率增高；
另一方面，加强Rh血型的检测，对确定为Rh(D)阴性的孕产妇，特别是有2次及以上妊娠史的，要加强这类孕产妇的意外抗体筛查及效价动态监测，结合胎儿大脑中动脉收缩期峰值流速等相关检查，对于病情进展快速的孕产妇，建议临床采取提前分娩措施，降低胎儿宫内溶血。
