发酵型柑橘红茶酒发酵工艺研究及挥发性成分分析

卫春会，吴 尧，薛 康，黄科屹，邓星成，邓 杰,*

（1.四川轻化工大学酿酒生物技术及应用四川省重点实验室，四川 宜宾 644000；
2.中国轻工业酿酒生物技术及智能制造重点实验室，四川 宜宾 644000；
3.成都海关技术中心，四川 成都 610041）

茶酒是以茶叶为主要原料，辅以水果或蔗糖等其他原料，经微生物发酵得到的兼具茶香与酒香的新型酒精饮料。目前市场上的茶酒以配制酒为主，但对发酵型茶酒的研究从未间断。刘琨毅等[1]通过单因素试验和响应面设计优化了米香型乌龙茶酒的生产工艺条件，获得亮黄透明、酒香与茶香和谐、滋味爽口的米香型乌龙茶酒，兼具米酒与乌龙茶的风味特征，酒精度为11.9%vol，多酚类物质含量为1.9 mg/mL。王琪等[2]以红茶与糯米为主要原料，发酵得到一款糯米茶酒，酒体呈黄褐色，酒香与茶香和谐，酒体丰满，不仅感官品质优良，还具有一定的保健价值。黄莹捷等[3]以夏秋茶树鲜叶与猕猴桃为原料，酿造得到一款猕猴桃茶酒，酒精度达9.03%vol，茶多酚和VC 含量分别为1 114.12 mg/L 和199.06 mg/L。此外还有石榴汁茶酒、葡萄茶酒、雪梨茶酒等，尚未有柑橘茶酒的相关研究。

柑橘与茶叶作为我国种植的传统植物，拥有悠久的种植历史，其中柑橘果实中含有许多生物活性物质，如类黄酮、类胡萝卜素、香豆素等，有抗癌、抗炎、抗菌等多种功效[4-10]；
茶叶中含有大量茶多酚、咖啡碱、蛋白质、茶黄素、茶红素、茶褐素等，对人体的健康有一定的积极作用[11-13]。因此，本研究以柑橘与红茶为发酵原料，通过单因素试验与正交试验优化柑橘红茶酒的发酵工艺，以期研制出兼具柑橘和红茶风味与营养的发酵型柑橘红茶酒，充分利用我国茶叶和水果资源，开辟柑橘深加工新途径，丰富酒产品的种类，具有广阔的应用前景。

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

红茶（政和功夫红茶）、柑橘（砂糖橘）、白砂糖，均为市售；
果酒活性干酵母，安琪酵母股份有限公司。试验所用试剂均为分析纯。

1.1.2 仪器与设备

MJ-25BM05C 榨汁机，广东美的精品电器有限公司；
WZS32 手持折光仪，上海仪电物光仪器有限公司；
XMT-100C 恒温培养箱，重庆市永生实验仪器厂；
DM3000 型正置生物显微镜，德国Leica 公司；
A360 紫外可见分光光度计，翱艺仪器（上海）有限公司；
7890A-5975B 气相色谱质谱联用仪，美国安捷伦公司。

1.2 方法

1.2.1 柑橘红茶酒生产工艺流程

红茶→浸提→过滤→冷却→加入柑橘汁→调糖、调pH→接种→发酵→过滤→澄清→灭菌→成品茶酒

1.2.2 操作要点

1.2.2.1 红茶汁的制备

称取红茶茶叶，以茶水质量比1∶10 加入冷水清洗2～3 次，按照茶叶与水质量比为1∶50 的比例添加热水，密封，80 ℃浸提30 min 后，用四层纱布趁热过滤。

1.2.2.2 柑橘汁的制备

将砂糖橘去皮榨汁，添加80 mg/L 焦亚硫酸钾护色杀菌，4 ℃冷藏备用。

1.2.2.3 调整成分

按柑橘汁与红茶汁质量比1∶15 的比例配制待发酵液，添加白砂糖调整发酵液初始糖度，添加酒石酸调整pH。

1.2.2.4 酵母的活化

称取1%果酒活性干酵母，加至4%的葡萄糖水溶液中，于28 ℃恒温培养箱中培养1～2 h，直至有大量气泡产生，镜检观察酵母活化程度，待其生长良好后终止培养。

1.2.2.5 酵母的扩大培养

取适量的柑橘红茶汁，调整糖度为10%，调pH值为4.5～5.0，按8%接种量对活化后的酵母进行扩大培养，在28～30 ℃下培养8 h，定时取样用显微镜观察酵母生长繁殖状况，确定其繁殖旺盛（酵母总数达107～108CFU/mL）且无杂菌污染时终止培养，获得一级种子发酵液。然后将一级种子液按照以上方法，在相同的条件下扩培12 h，获得二级种子液。

1.2.2.6 接种、发酵

将二级种子液按一定比例加入到发酵液中，摇匀，在28 ℃条件下静置发酵7 d。

1.2.2.7 过滤

用8 层纱布将柑橘果渣和红茶渣等沉淀物滤掉。

1.2.2.8 澄清

将茶酒置于密闭容器中，在4 ℃条件下冷藏5 d，将果酒上清液转移到新的容器中。

1.2.2.9 灭菌

采用巴氏灭菌法，加热至酒体中心温度达到65～70 ℃，保持20 min 进行灭菌。

1.2.3 红茶酒、柑橘酒生产工艺

红茶酒生产工艺参照邹聪丽[14]的操作方法；
柑橘酒生产工艺参照康明丽等[15]的操作方法。

1.2.4 柑橘红茶酒发酵工艺优化单因素试验

采用单因素轮换法，基础发酵条件为：柑橘汁与红茶汁质量比1∶15，初始糖度20%，接种量8%，初始pH 值4.5，发酵温度28 ℃，发酵时间7 d。基于基础条件，依次考察柑橘汁与红茶汁质量比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25）、初始糖度（16%、18%、20%、22%、24%）、初始pH 值（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0）、酵母接种量（6%、7%、8%、9%、10%）、发酵温度（22、24、26、28、30 ℃）及发酵时间（6、7、8、9、10 d）对柑橘红茶酒的酒精度、残糖含量及感官评分的影响。

1.2.5 柑橘红茶酒发酵条件正交试验优化

在单因素试验基础上，设计L9(34)正交试验，研究初始糖度、接种量、发酵温度对酒精发酵的影响，以发酵所得茶酒的酒精度、残糖量及感官评分为依据，确定最佳发酵条件。正交试验因素水平如表1 所示。

表1 柑橘红茶酒发酵条件优化的正交试验因素水平表Table1 Factors and levels table of orthogonal test

1.2.6 理化指标检验方法

总糖、总酸含量、酒精度：参照《酿酒分析与检测》[16]中的方法进行测定；
茶多酚含量：参照谢雨寻等[17]的方法进行测定。

1.2.7 柑橘红茶酒、红茶酒、柑橘酒风味物质GC-MS检测方法

参考康明丽等[15]的方法并稍作修改。

气相色谱条件：DB-WAX 毛细管色谱柱，规格为60 mm×250 μm×0.25 μm；
手动无分流进样，进样口温度为230 ℃；
程序升温：40 ℃保持1 min，然后5 ℃/min升温到180 ℃，保持1 min，再8 ℃/min 升温到230 ℃，保持7 min；
载气：高纯度氦气，流速为1 mL/min。

质谱条件：EI 电离源，电子能量70 eV，质量扫描范围20～500 u，离子源温度230 ℃，四级杆温度150 ℃，接口温度230 ℃，溶剂延迟3 min。

数据处理：通过GC-MS 分析检测得出柑橘红茶酒风味物质的总离子流图，采用数据分析软件进行谱库（NIST8.0）检索及相关文献分析，对相应的风味物质成分进行鉴定。

1.2.8 柑橘红茶酒感官评价方法

柑橘红茶酒感官评价方法如表2 所示。将柑橘红茶酒酒样置于通风良好的房间，由15 位受过专业培训的感官评定小组成员分别对柑橘红茶酒酒样进行感官品质评价[18-19]。

表2 柑橘红茶酒感官品质评价标准Table 2 Sensory quality evaluation criteria of citrus black tea wine

2.1 柑橘红茶酒生产工艺单因素试验结果

2.1.1 柑橘汁与红茶汁质量比对柑橘红茶酒感官品质的影响

柑橘汁与红茶汁的配比直接影响柑橘红茶酒的口感与香味。由表3 可知：当柑橘汁与红茶汁质量比为1∶5 时，酒体柑橘味过浓，茶香被柑橘香掩盖，无法展现红茶特有的香味；
质量比为1∶10 时，酒体呈淡黄色，以柑橘香为主，茶香较弱，整体欠佳；
当质量比为1∶20、1∶25 时，酒体呈黄褐色，柑橘味较弱，柑橘风味被红茶味掩盖，酒体协调性较差；
当质量比为1∶15时，感官评分最高，成品酒颜色为黄褐色，柑橘味与红茶味协调，既有柑橘的果香，又有红茶的清香。因此综合考虑，最终选定柑橘汁与红茶汁质量比1∶15 为最佳配比。

表3 不同柑橘汁与红茶汁配比的柑橘红茶酒感官评定结果Table 3 Sensory evaluation results of different orange juice and black tea ratios

2.1.2 柑橘红茶酒初始糖度的确定

由图1 可知，柑橘红茶发酵液初始糖度直接影响到柑橘红茶酒酒精度的高低与残糖量，初始糖度在16%～24%时，酒精度与残糖量随着初始糖度的增加而升高。当初始糖度为16%时，成品酒酒精度只有8.4%vol，酒精度低，酒香不足，酒体单薄、不丰满；
当初始糖度为22%时，酒精度为10.2%vol，并且感官评分最高，为83.06 分，此时酒体较为浓厚，酒香、果香、茶香纯净且协调，入口绵软、圆润；
当初始糖度继续增高时，酒精度的变化不明显，但是其口感却因残糖量的增加而变得甜腻。因此综合考虑，选取初始糖度20%、22%、24%进行正交试验。

图1 初始糖度对柑橘红茶酒酒精度、残糖量及感官评分的影响Fig. 1 Effect of initial sugar contents on the alcohol,residual sugar contents,and sensory scores of citrus black tea wine

2.1.3 初始pH 值的确定

发酵液酸碱度的高低对酵母菌的生长和代谢具有一定的影响，当pH 值低于3 时，酵母生长缓慢，生长繁殖受到抑制；
当pH 值高于5 时，酵母代谢产酒能力降低，同时容易造成发酵罐感染杂菌[20]。由图2可以看出，当发酵初始pH 值为3.5 时，产品酒精度只有8.7%vol，酒体不够浓厚，酸味大，酒液略显粗糙。当初始pH 值为5 时，酒精产量下降，酒味寡淡、杂味重且后味短；
发酵液初始pH 值为4.0 与4.5 时，酵母菌生长与代谢较佳，在初始pH 值为4.0 时酒精度最高，但当初始pH 值为4.5 时，感官评分最高，酒体入口绵甜，后味宜畅，茶香、柑橘果香浓郁。综合上述分析，选择初始pH 值为4.5 进行发酵。

图2 初始pH 值对柑橘红茶酒酒精度、残糖量及感官评分的影响Fig. 2 Effect of initial pH values on the alcohol,residual sugar contents,and sensory scores of citrus black tea wine

2.1.4 酵母接种量的确定

酵母接种量会影响酵母的发酵速率和呼吸产能。酵母接种量过高会导致酵母代谢产物增多，同时也会导致前期发酵过快，酵母出现早衰现象；
接种量过低则会导致发酵缓慢，增大发酵液染菌的风险[21]。如图3 所示，酒精度与感官评分随酵母接种量的增加呈现先增加后降低的趋势，感官评分在接种量7%时达到最大，在接种量8%时酒精产量最大。随着酵母接种量继续加大，酒精度降低，其原因可能是由于接种量过大，酵母在发酵前期生长繁殖过快，消耗了大量的糖类物质，并出现早衰的现象，导致后期产酒量降低，同时随着接种量的增加，柑橘红茶酒的酵母味也随之明显，口感欠佳。综上分析，选取接种量6%、7%、8%进行正交试验。

图3 接种量对柑橘红茶酒酒精度、残糖量及感官评分的影响Fig. 3 Effect of inoculation amounts on the alcohol,residual sugar contents,and sensory scores of citrus black tea wine

2.1.5 发酵温度的确定

由图4 可知，发酵温度对柑橘红茶酒产品的酒精度、风味与色泽都存在一定的影响。当发酵温度为22 ℃时，酵母生长代谢较为缓慢，发酵产酒较低，到发酵结束时酒精度仅为8.3%vol，残糖含量较高，此时酒香较弱，酒体寡淡；
当温度为30 ℃时，虽然酒精度较为理想，但是柑橘茶酒颜色暗沉，苦涩味较重；
当发酵温度为24、26、28 ℃时，酒精度均高于9%vol，此时发酵的柑橘红茶酒酒体丰满，口感醇厚，酸甜适中，颜色透亮红润，果香、茶香协调。因此综合考虑，选取发酵温度24、26、28 ℃进行正交试验。

图4 发酵温度对柑橘红茶酒酒精度、残糖量及感官评分的影响Fig. 4 Effect of fermentation temperatures on the alcohol,residual sugar contents,and sensory scores of citrus black tea wine

2.1.6 发酵时间的确定

由图5 可知，随着发酵时间的增加，酒精度呈先增加后趋于平缓的趋势，残糖量则呈现先减少后趋于平缓的趋势。经过分析可知前两天为前酵期，在这期间酵母菌通过利用营养物质大量生长繁殖，3～7 d 为主酵期，这个阶段酵母菌将发酵液中的糖转化为酒精。发酵5 d 后酒精度趋于稳定，此时酒体醇厚，略有苦涩味；
发酵第7 天时酒精度达到10.19%vol，此时酒体协调，口感柔和，感官评分最高。通过研究发现，发酵时间过短则发酵不完全，对柑橘红茶酒的风味有较大影响，而发酵时间过长，酒体的涩味与酵母味又较为明显，这可能与后期酵母的自溶现象有关，并且发酵周期过长，柑橘红茶酒遭受外界微生物污染的机会也越大。综合考虑，发酵时间定为7 d 较为理想。

图5 发酵时间对柑橘红茶酒酒精度及残糖量的影响Fig. 5 Effect of fermentation time on the alcohol and residual sugar contents of citrus black tea wine

图6 不同发酵时间柑橘红茶酒感官评分Fig. 6 Sensory scores of citrus black tea wine at different fermentation time

2.2 柑橘红茶酒发酵工艺正交试验结果

由表4 正交试验结果可知，极差由大到小为RA＞RB＞RC，即影响柑橘红茶酒发酵的因素主次顺序为：初始糖度＞接种量＞发酵温度。通过表5 的方差分析可知，因素A（初始糖度）对柑橘红茶酒发酵的影响极显著（P＜0.01）；
因素B（接种量）对柑橘红茶酒发酵的影响显著（P＜0.05）；
因素C（发酵温度）对柑橘红茶酒发酵的影响不显著。综合得出柑橘红茶酒发酵最佳工艺组合为A3B2C1，即初始糖度24%，接种量7%，发酵温度24 ℃。

表4 柑橘红茶酒发酵正交试验结果Table 4 Orthogonal test results of citrus black tea wine fermentation

表5 柑橘红茶酒发酵正交试验因素方差分析表Table 5 Variance analysis of orthogonal test factors of citrus black tea wine fermentation

2.3 柑橘红茶酒发酵工艺的验证试验结果

通过单因素试验与正交试验，得到柑橘红茶酒的最佳发酵工艺条件为：柑橘汁与红茶汁质量比1∶15，初始糖度24%，初始pH 值4.5，酵母接种量7%，发酵温度24 ℃，发酵时间7 d。按照最佳的发酵工艺条件进行验证，并检测相应的指标，结果见表6。在最佳发酵工艺条件下得到的最终产品酒体清澈透明，颜色为黄褐色，酒香宜人，有淡淡的柑橘香和红茶的花香与蜜香，酒体协调，入口醇和，余味甘爽。

表6 柑橘红茶酒的品质指标检测结果Table 6 The detection results of citrus black tea wine qualities

2.4 柑橘红茶酒、柑橘酒、红茶酒挥发性风味成分分析

红茶属于发酵茶，茶树的品种、地理环境与加工工艺等等都会对红茶酒的品质与香味造成影响，如金骏眉、川红等主要香气成分为芳樟醇、水杨酸甲酯、香叶醇、苯乙醇等，使得红茶具有不同程度的花香与蜜香[21-23]；
云南滇红的主要香气成分为苯乙醛、芳樟醇与水杨酸甲酯等，呈现出花香与蜜香；
祁门红茶主要香味物质为苯甲醛、香叶醇等，呈现出花香与蜜香[24-25]。由表7 可知，利用GC-MS 法在柑橘酒、红茶酒与柑橘红茶酒中共分离出49 种香味物质，且3 种酒样中的挥发性物质大致相似，主要是醇类、酯类及少量的酸类与醛类。醇类有异丁醇、2-乙基己醇、3-甲基-2-丁醇、2,3-丁二醇、正丁醇、异戊醇、苯甲醇、苯乙醇等；
酯类有乙酸乙酯、乙酸异戊酯、正己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、9-癸烯酸乙酯、乙酸苯乙酯、十二酸乙酯、己酸异戊酯等；
酸类有乙酸、丙酸、异丁酸、3-羟基-甲酯丁酸、己酸、正戊酸、辛酸等。上述3类物质相对含量占挥发性香气成分的90%以上。柑橘红茶酒中的香味物质的种类及含量较柑橘酒、红茶酒更加丰富，在红茶酒与柑橘红茶酒中未检出如芳樟醇、水杨酸甲酯等茶酒中的特征风味物质，但检出苯乙醇、苯甲醛与十二酸乙酯等具有花香的特征风味物质，并且与红茶酒相比有一定的提升，在柑橘红茶酒中异戊醇与苯乙醇的相对含量较高，异戊醇相对含量为47.46%，苯乙醇相对含量为19.12%，较好地保留了红茶与柑橘中的特征风味成分[26-28]。天然的异戊醇主要以酯的形式存在于部分植物中，具有苹果白兰地香气，苯乙醇具有新鲜面包香、清甜的玫瑰花香。酯类中乙酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯与乙酸苯乙酯的相对含量较高，乙酸乙酯具有果香味，辛酸乙酯具有类似菠萝的香气，癸酸乙酯类似于葡萄的香气，乙酸苯乙酯带有甜味、具有玫瑰花香气且带有可可的香味[29]。酸类物质对酒体的香气起到了促进作用，乙酸、丙酸、辛酸等酸类物质的存在使得柑橘红茶酒香味优雅，酒体协调。

表7 柑橘红茶酒、柑橘酒、红茶酒中香味成分的GC-MS 分析结果Table 7 GC-MS analysis results of aroma components in citrus black tea wine,citrus wine and black tea wine

续表7 柑橘红茶酒、柑橘酒、红茶酒中香味成分的GC-MS 分析结果Continue table 7 GC-MS analysis results of aroma components in citrus black tea wine,citrus wine and black tea wine

本试验采用微生物液态发酵的方法将柑橘与红茶有机结合，通过单因素及正交试验优化，得到柑橘红茶酒最佳发酵工艺条件为：柑橘汁与红茶汁质量比1∶15，初始糖度24%，初始pH 值4.5，酵母接种量7%，发酵温度24 ℃，发酵时间7 d。采用该工艺制作的柑橘红茶酒酒体澄清透亮，口感丰富、醇厚，酸甜适中，果香、茶香宜人，酒体协调。经GC-MS 检测，发酵型柑橘红茶酒中共检测出30 种香味物质，主体香气成分有苯乙醇、异戊醇、辛酸乙酯、癸酸乙酯、异丁醇、乙酸乙酯、十二酸乙酯等，是影响发酵型柑橘红茶酒品质、风味与特征的主要物质。当前，有关茶酒的特征风味成分研究较少，不同检测方法及条件之间差异较大，有些物质甚至无法检出，未来有待对茶酒的风味物质检测方法与条件进行进一步研究。