潘金清，汤佳馨，周佳敏，沈小媛，叶祥生，谭筱江
(南方医科大学南方医院 a.惠侨医疗中心；
b.呼吸与危重症医学科，广州 510515)
肺癌是世界范围内造成癌症相关死亡事件的主要原因[1]。非小细胞肺癌是肺癌的主要组织学类型，占肺癌病例的85%以上[2]，具有高转移和高复发的特点，包括以下4个亚型：肺腺癌、肺鳞状细胞癌(LUSC)、大细胞癌和肺神经内分泌癌，其中LUSC约占所有肺癌病例的30%[3]。目前LUSC的主要治疗方式包括手术、化疗、放疗、免疫治疗和靶向治疗等[4]。尽管肺癌的预防、诊断和治疗已经取得了较大进展，但肺癌患者的5年总生存率仅为19%[5]。
细胞焦亡是一种促炎形式的程序性细胞死亡，有大量研究表明焦亡过程在肿瘤发生和肿瘤治疗中起着关键作用，包括肺癌在内的多种肿瘤对诱导焦亡的治疗手段均敏感[6]。近年来，LUSC与长链非编码RNA(lncRNAs)之间的联系越来越受到重视。lncRNAs指长度超过200个核苷酸而不具有蛋白编码能力的RNA，其参与多种细胞活动，如脂肪生成、细胞凋亡、细胞焦亡、细胞分化、表观遗传修饰、肿瘤发生和调控等[7]。已有研究[8]表明lncRNAs与膀胱癌、胃癌、卵巢癌、非小细胞肺癌等多种癌症的发生发展密切相关。lncRNAs在非小细胞肺癌中调控细胞焦亡的作用也被证实[8]，但焦亡相关lncRNAs在LUSC中的作用仍有待探索，LUSC患者治疗或预后中涉及的焦亡相关lncRNAs尚不明确。
本研究通过生物信息学分析筛选肺鳞癌患者中具有预后价值的焦亡相关lncRNAs，并用于构建基于焦亡相关lncRNAs的预后风险评估模型，以期为肺鳞癌患者的预后预测提供参考。
LUSC患者的RNA转录组数据、临床信息均从TCGA数据库(https://portal.gdc.cancer.gov/)获取，只将随访信息完整的样本纳入分析。通过检索相关文献获得52个与焦亡相关的编码基因(mRNAs)[9]。经Pearson相关性分析计算焦亡相关基因表达量与差异lncRNAs相关性，以相关系数绝对值>0.4为焦亡相关的lncRNAs。再对所得焦亡相关的lncRNAs进行Pearson相关分析(|log2 Fold Change|>1，FDR<0.05)，获得焦亡相关的差异lncRNAs。
通过GSEA分析比较高、低风险2组间的KEGG通路差异。从TIMER2.0中下载免疫细胞浸润数据，采用R包(limma、GSVA、GSEABase、ggpubr、reshape2)进行分析，比较高、低风险2组间免疫细胞和免疫功能差异；
使用limma比较高风险组和低风险组在免疫检查点和m6A相关基因方面的差异。以P<0.05为差异具有统计学意义。
Pearson相关性分析鉴定出743个焦亡相关的lncRNAs，对焦亡相关lncRNAs进行差异分析(logFC>1;FDR<0.05)，得到277个焦亡相关的差异lncRNAs。单因素Cox生存分析显示，21个焦亡相关lncRNAs与肺鳞癌患者的总生存率相关(P<0.05)，包括LINC02555、PICART1、AC011511.5、MYOSLID、AC007823.1、AL136369.1、LANCL1-AS1、AP001189.1、AP001189.3、MIR3945HG、AL357054.4、LRRK2-DT、LINC01322、AC010422.4、AC112722.1、AL122125.1、AP001528.1、LINC02345、AC104248.1、AL606469.1、SFTA1P(图1)。进一步对上述21个lncRNAs进行多因素Cox生存分析，最终获得8个与预后相关的焦亡相关lncRNAs：PICART1、MIR3945HG、LINC01322、AC010422.4、AC112722.1、AL122125.1、AC104248.1、SFTA1P。
图1 21个与肺鳞癌患者的总生存率相关的焦亡相关lncRNAs
根据焦亡相关lncRNAs的表达及其相应的风险系数，计算每位LUSC患者基于该模型的风险评分。风险评分=PICART1×0.525 752 425+MIR3945HG×0.522 857 7+LINC01322×0.152 951 022+AC010422.4×(-1.180 751 205)+AC112722.1×0.713 017 253+AL122125.1×(-0.245 646 317)+AC104248.1×0.132 707 153+SFTA1P×(-0.016 397 794)。以风险评分的中位值(0.99)为阈值，将LUSC患者分为高风险组和低风险组，分别为246例和247例。Kaplan-Meier生存分析显示，高风险组半数总生存期为3年，而低风险组半数总生存期为6年，为高危组的2倍(图2)，低风险组的总生存期明显优于高风险组(P<0.001)。风险曲线表明高风险组患者的生存状态较差(图3A—B)。热图显示LUSC预后相关的8个焦亡lncRNAs在2组患者中表达量有明显差异，其中高风险组PICART1、MIR3945HG、LINC01322、AC112722.1、AC104248.1、SFTA1P的表达较低风险组显著上升，而AC010422.4、AL122125.1表达明显下降(图3C)。
图2 Kaplan-Meier生存分析
Patients(increasing risk socre)
Patients(increasing risk socre)
A：各样本风险评分散点图；
B：各样本生存状态散点图，绿色点表示生存，红色点表示死亡；
C：高、低危组8个焦亡相关lncRNAs表达水平热图。
将患者临床特征和风险评分结合进行单因素Cox分析，结果显示风险评分是LUSC患者的预后因素(P<0.001，图4A)。进一步将风险评分纳入多因素Cox分析，结果表明上述基于焦亡相关lncRNAs的风险评分可作为LUSC患者的独立预后因素(图4B)。ROC曲线显示1、2、3年生存率AUC值分别为0.632、0.643、0.645，说明风险模型预测患者预后的准确性尚可(图5A)，且焦亡相关lncRNAs预后模型优于年龄、性别、分期等预测指标(图5B)。热图展示了高、低风险组焦亡相关lncRNAs、年龄、性别、分期等的分布情况(图6)。
A：单因素；
B：多因素。图4 临床特征和基于焦亡相关lncRNA的风险评分的Cox回归分析
A：基于焦亡相关lcnRNAs的1、2、3年生存率预测；
B：基于焦亡相关lncRNAs、年龄、性别、分期的1年生存率预测。
图6 焦亡相关lncRNAs和临床特征相关热图
GSEA分析显示，高风险组差异基因富集于ECM受体相互作用通路(图7A)，而低风险组在剪接体和药物代谢细胞色素P450通路富集(图7B)。
A：高风险组；
B：低风险组。图7 KEGG通路富集分析
用TIMER、CIBERSORT、CIBERSORT-ABS、QUANTISEO、MCPCOUNTER、XCWLL、EPIC等数据库对高低风险组进行免疫细胞浸润情况分析，结果显示高风险组患者免疫细胞浸润丰度比低风险组高，如B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和NK细胞(图8A)。进一步对高、低风险组的免疫功能(图8B)及免疫检查点(图8C)进行比较，高风险组的APC共抑制分子、APC共刺激分子、趋化因子受体、免疫检查点、细胞活性、人类白细胞抗原、促炎因子、组织相容抗原、副炎症、T细胞共抑制、T细胞共刺激、Ⅰ型及Ⅱ型IFN应答免疫功能更强。
m6A是最丰富和可逆的RNA修饰，可以调节lncRNA的表达和生物学效应，m6A相关的lncRNA修饰在肿瘤诊断、治疗和预后中表现出出色的应用前景[12]。通过分析m6A相关基因在2组间的表达差异，发现m6A相关基因中HINRNPC、METTL3、YTHDC2、YTHDC1在高风险组中表达下降，而FTO、YTHDC1在高风险组中表达显著上升(图8D)。
A：免疫细胞浸润；
B：免疫功能；
C：免疫检查点；
D：m6A相关基因。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，ns P>0.05。
LUSC是肺癌最常见的组织病理类型，多发生于男性，与吸烟有关。高敏感性和高特异性的指标的缺乏使得LUSC的早期诊断较为困难[13]。随着对LUSC认识的加深，新的预后相关指标可为LUSC患者的治疗及评估预后提供新的策略。焦亡被认为是一种新的细胞死亡途径，近期有研究表明焦亡相关的lncRNAs有可能成为膀胱癌[14]、肺腺癌[6]、子宫内膜癌[15]、头部鳞状细胞癌[16]、骨肉瘤[17]等癌症的潜在分子标志物和治疗靶点。LI等[18]研究发现3个与LUSC焦亡相关的编码基因，但尚未有文献报道焦亡相关lncRNAs与LUSC的关联。lncRNAs存在于血液中故易于检测，可避免穿刺活检等带来的创伤[19]。而传统的肺肿瘤标志物如CEA、CA125、CYFRA21-1等的诊断价值有限[20]，因此，lncRNAs也有望成为肺癌早期诊断的标志物。
本研究利用已有数据库获取LUSC患者的转录组测序数据及其临床信息，构建了由8个lncRNAs(PICART1、MIR3945HG、LINC01322、AC010422.4、AC112722.1、AL122125.1、AC104248.1、SFTA1P)组成的预后预测模型。有文献报道PICART1可促进细胞凋亡和降低细胞活力，具有抗肺癌的作用[21]；
MIR3945HG被认为在LUSC预后中有很高的诊断价值[22]；
SUN等[23]研究表明LINC01322可作为LUSC的独立危险因素；
WENG等[12]研究发现AL122125.1是影响LUSC患者预后的独立因素；
FTA1P也是影响LUSC预后的重要lncRNAs[24]，LI等[25]研究显示SFTA1P可提高LUSC对顺铂的敏感性，可作为预测LUSC患者化疗反应和预后的生物标志物。
依据基于lncRNAs的风险评估模型的高、低风险组生存分析结果显示高风险组患者预后显著低于低风险组，且单因素和多因素Cox分析显示风险评分可以作为独立预后因子。KEGG富集分析发现高风险组在ECM受体相互作用通路富集，而ECM受体相互作用通路已被证实在前列腺癌、胃癌、胶质母细胞瘤、肺癌中表达异常，并参与肿瘤细胞的转移和浸润[26]。高风险组免疫细胞的浸润和功能比低风险组更为活跃。
肿瘤细胞的浸润、免疫功能以及免疫检查点抑制分子的表达可以影响肿瘤患者的预后，并预测免疫治疗的效果[27-28]。免疫浸润分析结果显示，高、低风险组在免疫细胞浸润、免疫功能、免疫检查点等方面的表达存在显著差异。进一步对m6A相关基因进行分析，发现高风险组中m6A相关基因HNRNPC、METTL3、YTHDC2、YTHDC1表达显著下调，而FTO表达显著上调。这与WENG等[12]的结果有相似之处。
本研究也存在一些局限性：一是所有数据均来源于数据库，未进行外部数据集验证；
二是对于8种焦亡相关的lncRNAs在LUSC发生发展中的分子机制联系未做进一步的研究和阐述。总之，本研究通过生物信息学的方法初步探讨了焦亡相关lncRNAs与LUSC预后之间的关系，筛选出了8个lncRNAs可能与LUSC的预后相关，为研究细胞焦亡与LUSC之间的关系提供了新的方向。
