FZD10,对非小细胞肺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

吴小凤，程大钊，詹日明，陈 黎，王天雨，余 华，张桂洪，唐旭东* （1.广东医科大学抗肿瘤活性物质研发协同创新中心，广东湛江 524023；
2.广东医科大学附属医院检验医学中心，广东湛江 524001；
3.广东医科大学生物化学与分子生物学研究所，广东湛江 524023）

肺癌是最常见的癌症[1]，死亡率居恶性肿瘤之首[2-3]。肺癌分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌（NSCLC），其中NSCLC 约占85%，侵袭、转移是NSCLC 致死的重要因素之一。FZD10 是Frizzle（FZD）家族中的一员，为类G 蛋白偶联受体。目前已有文献报道FZD10 在骨肉瘤[4]、胃癌[5]、滑膜肉瘤[6]等癌组织中高表达，而且还发现FZD10 与神经细胞、肿瘤细胞的增殖[7-8]及肿瘤的侵袭、转移有关[8-9]。Gugger 等[10]也证实FZD10 在肺鳞癌中高表达，但FZD10 在NSCLC 细胞增殖、侵袭、转移中的作用仍不清楚。因此，本文拟对此进行分析，以期进一步了解NSCLC 侵袭、转移的分子机制，为寻找NSCLC 防治的潜在靶点提供参考依据。

1.1 细胞株

正常人支气管上皮细胞（BEAS-2B）购自赛百慷（上海）生物技术股份有限公司（iCell Bioscience Inc）；
NSCLC 细胞株A549 和H1299 来自美国菌种保藏中心（ATCC）；
NSCLC 细胞株95C、95D、H460购自中国科学院细胞库，H1703 和PC-9 由本实验室保存。

1.2 主要试剂

兔抗人FZD10 抗体和兔抗人MMP-2 抗体为英国Abcam 公司产品；
兔抗人MMP-9 抗体为北京Bioss 产品；
结晶紫、CCK8 试剂盒、RIPA 裂解液、BCA 蛋白检测试剂盒均购自碧云天生物科技公司；
Matrigel 基质胶为美国BD 公司产品；
RT-qPCR 相关试剂PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）和SYBR® Premix Ex TaqTM II（Tli RNaseH Plus）均购自宝生物工程（大连）有限公司（大连TaKaRa 公司）；
FZD10-siRNA 及转染试剂DharmaFECTTM Transfection Reagents-SiRNA 均购自美国Thermo 公司。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养 NSCLC 细胞（H1299、A549、H460、H1703、PC-9、95C、95D）和BEAS-2B 细胞置于含10% 胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 mg/L 链霉素的RPMI-1640 培养液中，37 ℃、5% CO2条件下传代培养。

1.3.2 细胞转染 参照美国Thermo 公司转染试剂DharmaFECTTM Transfection Reagents-SiRNA 说明书进行操作，在95D 细胞中转染FZD10-siRNA，并将细胞分成3 组：（1）模拟转染组（Mock）：仅加转染试剂；
（2）非特异siRNA 转染组(Si-CTR)：转染非特异siRNA；
（3）FZD10-siRNA 转染组（Si-FZD10）：转染特异性FZD10-siRNA。在所有转染实验中FZD10-siRNA 的终浓度均为25 nmol/L，在96 孔板中加入FZD10-siRNA 2.5 pmol，在6 孔板中加入FZD10-siRNA 50 pmol。

1.3.3 CCK8 细胞增殖实验 将100 μL 95D 细胞悬液接种于96 孔板（细胞数为2 500 个/孔）培养12 h 后转染，分别在24、48、72 h 时更换培养基为含有CCK8试剂的完全培养基100 μL，培养1～2 h，在波长为450 nm 条件下检测吸光度值。

1.3.4 迁移、侵袭实验 将95D 细胞接种到6 孔板中，瞬时转染FZD10-siRNA 24 h 后，将已转染细胞用胰酶消化、离心、去上清，再用含10% FBS 的基础培养基重悬细胞沉淀并制成细胞悬液；
在Transwell 板的下室缓慢加入700 μL 完全培养基（避免出现气泡），上室（侵袭实验应提前包被Matrigel 基质胶）加入细胞悬液（细胞数为30 000 个/孔），每孔细胞悬液体积不超过200 μL。培养24 h 后，用棉签擦拭上室，于4%多聚甲醛中固定25～30 min，再用结晶紫在室温下染色10 min，清洗、晾干后在倒置显微镜下观察并拍照。结果使用Image J 软件进行分析。

1.3.5 Western blot 使用强RIPA 裂解液分别裂解3 组转染细胞，提取总蛋白，使用BCA 法检测蛋白原液浓度，再进行SDS-PAGE 电泳（100 V 电泳约2 h），转膜、电转（100 V 电转1.5 h）、封闭；
分别加兔抗人FZD10、MMP-2、MMP-9 抗体（1∶1 000）4 ℃孵育过夜后，用PBST 缓冲液洗涤3 次；
用HRP 标记的第二抗体（1∶2 000）常温孵育1～2 h，再用PBST 缓冲液洗涤3 次；
用ECL 化学发光检测信号，Image J 软件进行灰度值分析，将GAPDH 用作内参对照。

1.3.6 RT-qPCR 使用Trizol 分别裂解3 组转染细胞，提取总RNA，选择A260/ A280为1.8～2.0 的样品，RTqPCR 操作参照文献[11-12]。FZD10 的扩增引物序列为F:5′-AGCAGGTCTCTACCCCCATC-3′和R: 5′-TAATC GGGGAGCACTTGAGC-3′（GenBank No.NM_007197.4），GAPDH 的扩增引物序列为F: 5′-ATGAATGGGCAGC CGTTAGG-3′和R: 5′-CCCAATACGACCAAATCAGA-GAT-3′（GenBank No.NM_001256799.2），所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。扩增条件为42 °C 5 min，95 °C 10 s，再 40 个循环（95 °C 5 s,60 °C 31 s）。结果以2-△△Ct对扩增产物进行相对定量分析，GAPDH 为内参对照。

1.4 统计学处理

采用GraphPad Prism 6.0 软件进行统计学分析，所有实验均重复3 次，数据以表示，组间比较采用单因素方差分析及LSD 检验，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2.1 FZD10 在NSCLC 细胞中的表达

Western blot 结果（图1）显示：与BEAS-2B 细胞相比，除A549 和H460 细胞外，在其他NSCLC 细胞H1299、95D、95C、H1703、PC-9 中的FZD10 蛋白水平明显升高，特别是在95D 细胞中表达最高，因此我们选择该细胞进行后续实验。

图1 NSCLC 细胞和正常肺上皮细胞的FZD10 表达

2.2 FZD10 敲低对95D 细胞增殖、迁移和侵袭的影响

从图2 可见，在95D NSCLC 细胞中敲低FZD10，与Mock 组和Si-CTR 组比较，Si-FZD10 组细胞的FZD10 蛋白和mRNA 的表达都明显受抑（P＜0.05 或0.01），说明FZD10 在95D 细胞中被成功敲低。CCK8检测结果（图3）显示：Si-FZD10 组细胞的增殖被抑制，且在转染72 h 时抑制显著（P＜0.05）；
Transwell 小室实验结果（图4、5）显示：Si-FZD10 组细胞的迁移和侵袭能力明显降低（P＜0.01），而Mock 组和Si-CTR组细胞的迁移、侵袭能力差异无统计学意义（P＞0.05），说明FZD10 的敲低可抑制95D 细胞的增殖、迁移和侵袭。

图2 FZD10 的敲低效果分析

图3 敲低FZD10 对95D 细胞增殖能力的影响（n=3，*P＜0.05）

图4 敲低FZD10 对95D 细胞迁移能力的影响

图5 敲低FZD10 对95D 细胞侵袭能力的影响

2.3 FZD10 敲低对95D 细胞MMP-2 和MMP-9 蛋白表达的影响

图6 可见，与Mock 组、Si-CTR 组比较，Si-FZD10组细胞的MMP-2 和MMP-9 蛋白表达均明显降低（P＜0.05）。

图6 敲低FZD10 对95D 细胞MMP-2 和MMP-9 蛋白表达的影响

NSCLC 是临床上常见的恶性肿瘤，尽管近年来由于靶向药物和免疫治疗的临床应用使NSCLC 的疗效显著提高[13-14]，但NSCLC 发病机制复杂，涉及的信号分子繁多，治疗后的NSCLC 还是面临较大的复发和转移的风险，而目前有关肺癌转移的分子机制还不完全清楚。

FZD10 是Frizzle 家族中的一种蛋白受体。研究发现其在肺鳞癌等多种肿瘤组织中表达上调[4-6，10]。但最近Zhang 等[15]却报道在45 岁以下的NSCLC 患者组织中FZD10 mRNA 的表达下调，这与Gugger 等[10]所报道的FZD10 在肺鳞癌中过度表达不一致。这些报道结果的差异说明FZD10 在NSCLC 中的表达还存在争议。为进一步证实FZD10 在NSCLC 中的表达情况，本文采用Western blot 技术分析了NSCLC 细胞株中FZD10 蛋白的表达，结果发现FZD10 蛋白在NSCLC 细胞株H1299、95C、95D、H1703、PC-9 中都呈现高表达（图1）。

有研究显示，FZD10 的表达与Survivin 的表达相关，且两者的高表达可作为骨肉瘤诊断、恶性程度判断的重要指标[4]；
而且，通过综合分析TCGA 与GEO甲基化数据发现FZD10 可能为胆管癌预后的相关基因[16]；
特别是FZD10 的表达还被报道可影响胃癌细胞的增殖和侵袭能力[5]，并且可能成为滑膜肉瘤[6]、结肠癌[17]治疗的靶点。这些报道说明，FZD10 在肿瘤的发生、发展中具有重要作用。本文发现FZD10 蛋白在具有高转移潜能的NSCLC 细胞95D 中表达最高（图1），初步说明FZD10 表达可能与NSCLC 转移有关。

为进一步探讨FZD10 在NSCLC 转移中的作用，本文通过RNA 干扰技术敲低95D 细胞中FZD10 的表达，分析FZD10 对NSCLC 细胞增殖、迁移、侵袭的影响。结果发现，用特异性FZD10-siRNA 敲低FZD10 后，可以明显抑制95D 细胞的增殖（P＜0.05，图3）、迁移（P＜0.01，图4）和侵袭能力（P＜0.01，图5），提示FZD10可能在NSCLC 转移中起重要作用。

基质金属蛋白酶属锌依赖性内肽酶家族，其中MMP-2、MMP-9 与基底膜降解、血管生成相关，参与调控肿瘤的侵袭转移过程[18]。为研究FZD10 增强NSCLC 细胞95D 增殖、迁移、侵袭能力的机制，本文进一步分析了FZD10 对NSCLC 细胞MMP-2 和MMP-9 表达的影响，结果表明敲低FZD10 后95D细胞中MMP-2 和MMP-9 蛋白的表达均显著降低（P＜0.05，图6）。本文结果初步说明，FZD10 可能通过上调MMP-2 和MMP-9 的表达增强NSCLC 细胞的增殖、迁移和侵袭能力，从而促进NSCLC 转移，提示FZD10 可能是NSCLC 防治的潜在靶点。