高山兀鹫拉奎拉棒状杆菌和肠球菌属的分离鉴定

粟玉刚　李向勇　李蜜　刘彬　彭丛笑　夏青珍　刘友琼

摘 要：从动物园发病死亡的高山兀鹫的肝脏、心脏血液、胰脏中分离到2种菌株。经形态学观察、革兰氏染色和分子生物学鉴定最终确定2种菌株分别为拉奎拉棒状杆菌和肠球菌属。本次试验结果为高山兀鹫生物学特性研究提供了技术支撑。

关键词：高山兀鹫、拉奎拉棒状杆菌、肠球菌属、分离鉴定

中图分类号：S858.39     文献标识码：B 文章编号：1673-1085（2023）07-0054-04

高山兀鹫（Gypshimalayensis），又名喜马拉雅兀鹫，鹰形目（Accipitriformes）、鹰科（Accipitridae）[1-2]、秃鹫亚科（Aegypiinae），属于大型猛禽，国家二级保护鸟类，被列入濒危野生动植物国际贸易公约（CITES公约）附录Ⅱ限制贸易鸟类。高山兀鹫集中分布于我国的西部高山、高原地区，为不易归类的分布型鸟，生活在海拔2 500～4 800 m区域。资料显示生活在珠穆朗玛峰自然保護区的高山兀鹫，秋季沿横断山脉向南迁徙至云南西部，或越过喜马拉雅山脉到印度、缅甸等地越冬[3-4]。高山兀鹫体长120～150 cm，体重可达8～12 kg，于高空翱翔，飞行状态时翼尖而长，略向上扬[5]，有时结小群活动，或停栖于多岩峭壁，以腐肉为食，对维持生态系统平衡有重要意义。本研究从动物园一例死亡的高山兀鹫的肝脏、心脏血液、胰脏等病料分离出细菌，经革兰氏染色进行形态学观察，并通过分子生物学检测鉴定分离菌为拉奎拉棒状杆菌和肠球菌属，从而为高山兀鹫的疾病防治和动物园饲养提供理论依据和有益参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 长沙生态动物园一例死亡的高山兀鹫采集其肝脏、心脏血液、胰脏等脏器组织作为病料样品。

1.1.2 主要试剂 血琼脂培养基购自郑州贝瑞特生物技术有限公司，药敏纸片套装购自常德比克曼生物科技有限公司，DL5000 marker购自北京索莱宝科技有限公司，Premix Taq? （TaKaRa Taq? Version 2.0）、Nuclease-free Water购自TakaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离与革兰氏染色鉴定 将死亡的高山兀鹫肝脏、心脏血液、胰脏等进行组织处理后严格按照无菌操作，用高温灼烧后的接种环蘸取少量病变组织液在血琼脂培养基上进行划线接种，在37℃恒温箱培养18 h后，分别挑取不同形态的单菌落并编号为1号、2号菌，通过平板划线法再次接种于血琼脂平板进行纯化，挑取少量纯化后的单菌落适当稀释后进行革兰氏染色鉴定。

1.2.2 细菌16S rDNA基因序列扩增 用无菌接种环分别挑取不同形态的纯化后的1号、2号菌，接种于150 ?L灭菌超纯水中混匀，按照DNA提取试剂盒提取细菌基因组DNA，根据先前研究[6]合成用于PCR扩增细菌16S rRNA基因序列的通用引物，16S rRNA-27F：5"-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3"；
16S rRNA-1492R：5"-GGCTACCTTGTTACGACTT-3"，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。PCR反应总体系25 ?L，包括Premix Taq? 12.5 ?L，上下游引物各0.5 ?L，DNA模板1.0 ?L，Nuclease-free Water 10.5 ?L。反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸90 s，共35个循环，最后72℃再延伸5 min。PCR反应结束后取5.0 ?L PCR产物进行琼脂凝胶电泳，观察结果。将扩增的阳性PCR产物送至北京擎科生物科技有限公司测序，将测序回来的结果使用DNAMAN拼接好后，提交至NCBI进行Blast比对，同源性≥99%可以定义到种的水平；
若同源性在97.0%～98.9%，可以定义到属的水平；
若同源性＜97.0%，则定义为科水平，鉴定标准按照同源性≥97.0%判定[7]。

2 结果

2.1 细菌形态及革兰氏染色观察结果

接种病料组织液后的血琼脂培养基，经观察发现表面长有两种形态不同的菌落，1号菌落为圆形、灰白，呈水滴状，革兰氏阳性菌，镜检显示两端膨大呈棒状，排列不规则，如图1；
2号菌落形状不规则、灰白色，个别呈刺突状，革兰氏阳性菌，镜检呈圆形或椭圆形短链状排列，如图2。

2.2 PCR扩增及序列分析结果

用细菌通用引物对其16S rDNA基因序列进行扩增，凝胶电泳结果如图3所示，菌1和菌2均扩增出大小约为1 500bp的片段，进一步测序分析结果发现该两种菌株序列分别与已知拉奎拉棒状杆菌和肠球菌属同源性高于99%，提示获得分离株为拉奎拉棒状杆菌和肠球菌属。同源性分析结果见表1。

3 讨论

本试验通过细菌形态、革兰氏染色鉴定及PCR扩增及序列分析，从发病高山兀鹫的肝脏、心脏血液、胰脏中分离到拉奎拉棒状杆菌和肠球菌属2种菌株。关于拉奎拉棒状杆菌在高山兀鹫粪便、病料等检出的文献研究较为少见[8]。肠球菌属为当前益生菌研究的热点，多种常见的肠球菌菌株已广泛应用于多种发酵食品、药物和微生态制剂当中[9]。对于高山兀鹫这种食腐食性猛禽，其肠道中的肠球菌属对其消化腐食以及抑制腐食中病原菌所发挥的作用是值得深入研究的课题，其对于进一步研究高山兀鹫的生态习性等具有重要意义[10]。

拉奎拉棒状杆菌和肠球菌属的病原体大多毒力不高或致病性不强，一些是条件性致病菌，疾病的发生常与创伤或动物的免疫力低下有关。该例高山兀鹫死亡前经历笼舍调整，由大的开放笼舍转移到面积小的封闭笼舍，可能存在飞行等行为无法得到有效满足这一诱因。此外结合剖检结果，不排除其因机体抵抗力降低，伴随细菌感染后发病死亡的可能。因此，在高山兀鹫圈养实践中应从笼舍环境与其生活习性之间的关系及疫苗接种、饲养环境的消杀灭源等疫病防控措施作进一步探讨，本研究为高山兀鹫的动物园饲养和疾病防治提供理论依据和有益参考。

参考文献：

[1]   郑光美.中国鸟类分类与分布名录[M].3版. 北京：科学出版社，2017.

[2]  Bird Life International. Gyps himalayensis[EB/OL]. The IUCN red list of threatened species 2017.[2020-11-09].http：//dx.doi.org/10.2305/IUCN.UK.2017-3.RLTS.T22695215A118594518.en.

[3]  胡慧建， 陈邵峰， 田园.活在世界之巅—珠穆朗玛峰国家级自然保护区的野生动物[M].广州：
南方日报出版社，2014：92.

[4]  韩联宪， 彭建生.纳帕海的鸟[M].北京：
中国大百科全书出版社， 2014：90.

[5]  王斌， 胡慧建， 李晶晶， 等.珠穆朗玛峰国家级自然保护区鸟类[M].长沙：湖南师范大学出版社，2014：36.

[6]  Weisburg W， Barns S M， Pelletier D A， et al.16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study[J].Journal of bacteriology，1991，173（2）：697-703.

[7]  王炜强，孙浩云， 杨志松.动物园梅花鹿源肺炎克雷伯氏菌的分离鉴定及耐藥性[J].野生动物学报，2022，43（01）：220-223.

[8]  Fernández-Garayzábal J F， Egido R， Vela A I， et al. Isolation of Corynebacterium falsenii and description of Corynebacterium aquile sp. Nov.， form eagles[J].International journal of systematic and evolutionary micrbiology，2003，53（4）：1135-1138．

[9]  侯建平， 郑思思， 龙鑫， 等.高山兀鹫肠道微生物分离鉴定与耐药性分析[J].野生动物学报，2021，42（02）：460-469.

[10] 鲁旭， 张影， 曾明．益生性肠球菌安全性评价研究进展与监管[J].中国药事，2019，33（05）：
555-560．

第一作者简介：粟玉刚（1985—），女，湖南长沙人，中级兽医师，主要从事动物疾病治疗与防治工作，E-mail：412635016@qq.com。

*通信作者简介：李向勇（1981—），男，河南周口人，高级兽医师，主要从事动物疾病治疗与防治工作，E-mail：29778693@qq.com。