依洛尤单抗预处理对小鼠心梗后心衰的改善作用及其机制

任高彤,李甜甜,封仁乾,王 迪,苏 瑞,亓秉超,张明明,李 妍*

(1空军军医大学唐都医院心内科,西安 710032;2空军军医大学基础医学院;*通讯作者,E-mail:profleeyan@163.com)

心血管疾病在全球范围内发病率一直居高不下,是全球疾病致死的首要原因,全球死亡患者中1/3死于心血管疾病,中国因心血管疾病死亡人数居世界第一位[1]。《中国心血管健康与疾病报告2021》指出,城乡居民疾病死亡构成比中,心血管疾病占据首位[2]。心力衰竭是大多数心血管疾病共有的终末期表现,心力衰竭位列成人中住院病因的首位,心衰患者5年生存率甚至低于前列腺癌患者和乳腺癌患者[3,4]。急性心肌梗死是近20年心力衰竭最常见的病因[5]。心肌梗死后心肌细胞凋亡和心肌纤维化是不良心肌重塑的重要病理特征,也是导致心力衰竭的主要原因[6,7]。随着介入治疗和药物治疗的不断发展,心梗患者住院期间和心梗后1年死亡率大大下降,但是心梗后心衰的发生率和死亡率依然很高[8-10]。探讨心梗后心衰的发病机制,提出针对性的治疗方法,对心梗后心衰的临床治疗具有重要意义。

前蛋白转化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9, PCSK9)可以介导低密度脂蛋白(low-density lipoprotein, LDL)受体的内吞并使其降解,减少肝细胞对低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C)的回收降解,导致循环中LDL-C含量升高[11-13]。PCSK9的单克隆抗体依洛尤单抗能够使冠心病患者在应用他汀列类降脂药物的基础上进一步降低LDL-C达59%,使心血管不良事件下降13.7%[14]。随着PCSK9研究进展,PCSK9作用于脂代谢以外的多效性也得到了越来越多的证据支持。PCSK9能够结合心肌细胞、平滑肌细胞、内皮细胞等多种细胞类型,在心梗、动脉粥样硬化等多个病理生理过程中发挥重要作用[15]。例如,心梗后心肌组织PCSK9表达水平升高,升高的PCSK9促进了心肌细胞的凋亡和自噬[16,17]。依洛尤单抗的临床研究逐渐聚焦于急性心肌梗死患者等高危人群中依洛尤单抗用药的启用时机[18-20]。目前依洛尤单抗心梗前用药的相关研究较少,因此,本研究旨在探讨依洛尤单抗预处理对小鼠心梗后心衰的保护作用,并探讨其可能的非脂代谢依赖的作用机制。

1.1 实验动物

6～8周龄SPF级野生型雄性C57BL/6J小鼠和1～3日龄SD大鼠乳鼠购自空军军医大学动物中心,所有小鼠均在恒温恒湿动物房中饲养。所有动物实验的设计和操作都严格遵守空军军医大学发布的动物实验手册。

1.2 主要试剂及仪器

PCSK9一抗购自美国Abcam公司;Caspase-9一抗购自中国爱博泰克生物科技有限公司;β-actin一抗、SIRT3一抗、羊抗兔二抗购自中国三鹰生物技术有限公司;ABP、BNP引物购自中国生工生物工程股份有限公司;BCA蛋白定量试剂盒购自美国Thermo公司;RNAiso试剂盒、PrimeScript RT试剂盒、TB-green购自日本TAKARA公司;si-SIRT3购自中国擎科生物科技有限公司;TUNEL试剂盒购自美国Bio-Rad公司;Annexin Ⅴ-PE/7AAD细胞凋亡检测试剂盒购自中国索莱宝科技有限公司。酶标仪购自美国Thermo公司;RT-PCR仪购自美国Bio-Rad公司;蛋白印迹成像系统购自美国Bio-Rad公司;小鼠心脏功能超声系统购自加拿大Visual Sonics公司;小鼠麻醉所用异氟烷购自中国一品制药股份有限公司;鼠尾注射静脉显像仪购自中国卡尔文生物科技有限公司;依洛尤单抗溶液购自美国Amgen公司。

1.3 小鼠心肌梗死模型的建立和动物实验分组

取6～8周龄的雄性C57BL/6J小鼠行心梗造模[21]。用异氟烷麻醉小鼠,于小鼠左侧胸骨中线4～5肋间做一切口,将心脏从切口处挤出胸腔外,轻柔固定后于左心房下方1～2 mm处用6-0丝线行冠脉左前降支(LAD)结扎术,结扎后肉眼可见LAD支配区域心肌组织变白。心脏还纳于胸腔后缝合切口,小鼠心电图和小鼠心脏超声均提示心梗模型建立成功。

C57BL/6J小鼠被随机分为3组:假手术组(sham组)、心梗组(MI组)和心梗+依洛尤单抗预处理组(MI+Evolo组),每组小鼠51只。sham组小鼠行完全相同的手术流程但未结扎冠脉,MI组小鼠行心梗手术并结扎冠脉,MI+Evolo组小鼠行心梗手术并结扎冠脉,且在手术前4 h尾静脉注射依洛尤单抗溶液[22]。小鼠尾静脉注射依洛尤单抗的操作方法:将小鼠放入小鼠固定器,置于鼠尾注射静脉显像仪上,用50 μl注射器吸取依洛尤单抗溶液,于鼠尾中上段沿鼠尾静脉斜行进针,轻柔推注依洛尤单抗溶液,静脉腔内血液被溶液冲压消失即为尾静脉注射成功。依洛尤单抗用药剂量为10 mg/kg体质量,给药时间为手术前4 h[22]。

1.4 Western blot检测PCSK9、SIRT3、cleaved Caspase-9的蛋白水平

用PBS清洗小鼠心肌组织3次,剪碎后用充分研磨。加入RIPA裂解液,充分裂解细胞,取上清液行BCA蛋白定量。蛋白提取全程于4 ℃低温条件下进行。原代心肌细胞提取蛋白先用PBS轻柔冲洗细胞,随后直接添加RIPA裂解液,后续步骤与组织提取蛋白相同。根据定量结果调整各样本上样体积,按照Western blot实验流程进行操作,采用10% SDS-PAGE凝胶分离蛋白,转至PVDF膜。5%脱脂奶粉常温封闭PVDF膜60 min,TBST溶液漂洗,4 ℃条件PCSK9一抗1∶1 000、SIRT3一抗1∶1 000、cleaved Caspase-9一抗1∶1 000孵育过夜。TBST溶液漂洗PVDF膜3次。室温下羊抗兔二抗1∶5 000孵育60 min,TBST溶液漂洗PVDF膜3次。A液、B液体积1∶1配制发光液,用化学发光法检测目的蛋白条带,用蛋白印迹成像系统记录条带,以β-actin为内参蛋白进行目的蛋白定量分析。

1.5 qRT-PCR法检测心房钠尿肽(ANP)、脑钠肽(BNP)的mRNA水平

按照TAKARA公司RNAiso试剂盒实验操作流程,提取心肌组织和原代心肌细胞的总RNA,使用PrimeScript RT试剂盒行反转录获取cDNA,最后用TB Green预混的TaqⅡ酶进行实时定量PCR。检测小鼠心梗后7,14,28 d心肌组织ANP、BNP的mRNA水平;检测缺氧处理3,6,9 h原代心肌细胞ANP、BNP的mRNA水平。RT-PCR仪设定的循环参数如下:95 ℃ 30 min,95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,循环40次。以β-actin为内参进行相对定量分析。

1.6 超声心动图检查

超声心动图检查前24 h,将小鼠胸前区域脱毛。用异氟烷持续吸入麻醉小鼠,将小鼠放置于恒温操作板上,超声探头置于小鼠胸骨旁长轴切面,获取M型超声心动图。用超声心动仪配套软件测算左心室射血分数、左心室短轴缩短率、左心室内径。

1.7 心肌梗死及心肌细胞的凋亡检测

心梗造模后7,14,28 d,分别在sham组、MI组和MI+Evolo组中随机选取8只小鼠行心脏取材。用异氟烷麻醉小鼠,脱颈法处死,随后开胸取心脏。将小鼠心脏用4%甲醛固定过夜,常规石蜡包埋,切片厚5 μm。心梗后7 d的心脏切片行TUNEL染色以观察心肌细胞的凋亡情况,心梗后14,28 d的心脏切片行Masson染色以观察心肌梗死面积。染色封片后使用共聚焦激光扫描显微镜观察并拍照,用Image J软件进行定量分析。

1.8 小鼠心室肌组织转录组测序

心梗建模后3 d,分别在sham组、MI组和MI+Evolo组中随机选取3只小鼠,取各小鼠心室肌组织,Trizol法提取小鼠心室肌总RNA,进行质量控制,检测RNA完整性,富集mRNA。使用美国Illumina生物技术公司RNA-seq样本制备试剂盒(mRNA-Seq sample preparation kit),严格按照试剂盒说明书构建cDNA文库。进行Illumina Novaseq 6000、PE150测序,对照小鼠的基因组信息和完整的转录组信息,将测序出的reads进行注释、定量和分析。

1.9 原代心肌细胞的分离、培养和细胞实验分组

将1～3日龄SD大鼠乳鼠在75%酒精中充分浸泡,乳鼠体表消毒后置于细胞实验室超净台内,摘取乳鼠心脏,置于无菌PBS中,清洗血液,充分剪碎乳鼠心脏,置于无菌玻璃瓶中。加入1 mg/ml的Ⅰ型胶原酶5 ml,移液枪轻柔吹打混匀剪碎的心肌组织,用高压灭菌过的瓶盖密封玻璃瓶,在37 ℃孵箱中消化心肌组织5 min,轻柔吸取上层消化液,加入盛有含10%胎牛血清DMEM培养基的5 ml离心管中以终止消化。重复消化5～6次直至心肌组织消化完毕。收集消化后所得细胞混悬液,800 r/min室温下离心5 min,弃上清后所得沉淀即为原代心肌细胞和成纤维细胞。用添加10%胎牛血清的DMEM培养基重悬沉淀后种植于小培养瓶,37 ℃孵箱中静置2 h,使成纤维细胞贴壁,此时原代心肌细胞未贴壁而处于悬浮状态。最后,将小培养瓶中的培养基转移至6孔板培养48 h,原代心肌细胞即可充分贴壁。

原代心肌细胞分为4组:对照组(Con组)、缺氧组(hypoxia组)、缺氧+依洛尤单抗预处理组(hypoxia+Evolo组)和缺氧+依洛尤单抗预处理+SIRT3干扰组(hypoxia+Evolo+si-SIRT3组)。Con组细胞未进行任何处理;缺氧组细胞置于缺氧细胞培养箱中缺氧3 h;hypoxia+Evolo组细胞缺氧前5 min培养基中添加依洛尤单抗溶液,给药浓度为100 μg/ml[22],随后将细胞置于缺氧细胞培养箱中缺氧3 h;hypoxia+Evolo+si-SIRT3组细胞缺氧前48 h用si-RNA转染原代心肌细胞并在缺氧前5 min培养基中添加依洛尤单抗溶液,随后将细胞置于缺氧细胞培养箱中缺氧3 h。细胞实验每组3个样本。si-RNA转染原代心肌细胞的操作方法:取贴壁的原代心肌细胞。提前准备2个试管,1个试管的培养基中包含si-RNA转染试剂LipofectamineTMRNAiMAX,另1个试管的培养基中包含si-RNA,将两个试管内容物轻柔混合均匀,在室温下孵育5 min,随后进行细胞转染。si-RNA共转染48 h,其后可行细胞干预。

1.10 流式细胞术检测原代心肌细胞凋亡

使用胰酶将贴壁的原代心肌细胞消化至细胞悬液,等体积细胞培养基中和胰酶,离心获得细胞团块。PBS重悬细胞,使用Annexin Ⅴ-PE/7AAD细胞凋亡检测试剂盒,严格按照试剂盒说明书操作流程染色,用流式细胞仪获得数据并定量分析。

1.11 统计学分析

看完信，阿强觉得好笑，以为是谁的恶作剧，但也没有掉以轻心，出门进门都小心翼翼。三天过去了，家里一样东西也没有少，阿强逐渐放松了警惕。第四天，阿强在家休息，忽然听到一个女子的惊叫声从门外传来：“来人呀，快抓流氓呀！”

2.1 心梗后小鼠心肌组织中PCSK9,SIRT3,ANP,BNP水平变化

心梗后7,14,28 d小鼠心肌组织中PCSK9表达水平明显升高,SIRT3表达水平明显下降(均P<0.05,图1)。心梗后14 d PCSK9表达增加最为显著,心梗后28 d PCSK9表达水平相较心梗后14 d有所下降。与sham组相比,MI组小鼠心肌组织中ANP、BNP mRNA水平均升高(P<0.05,见图1)。

与sham组比较,*P<0.05,**P<0.01

2.2 缺氧处理的原代心肌细胞中PCSK9,SIRT3,ANP,BNP水平变化

在缺氧处理3,6,9 h的原代心肌细胞中,PCSK9表达水平明显升高,SIRT3表达水平明显下降(P<0.05,见图2),与心梗后小鼠心肌组织中PCSK9、SIRT3表达变化情况保持一致。缺氧处理组原代心肌细胞中ANP、BNP mRNA水平明显高于Con组(P<0.05,见图2)。

与Con组比较,*P<0.05,**P<0.01

2.3 依洛尤单抗预处理改善小鼠心梗后心脏收缩功能

心梗后28 d,超声结果显示MI组小鼠心脏收缩功能明显下降,表现为MI组小鼠左心室射血分数、短轴缩短率低于sham组(P<0.05),收缩期左室内径高于sham组(P<0.05,见图3)。相比于MI组,MI+Evolo组小鼠心脏收缩功能有所改善,表现为MI+Evolo组小鼠左心室射血分数、短轴缩短率高于MI组(P<0.05,图3),收缩期左室内径低于MI组小鼠(P<0.05,见图3)。

与sham组比较,*P<0.05,**P<0.01;与MI组比较,#P<0.05,##P<0.01

2.4 依洛尤单抗预处理减少小鼠心梗后心脏梗死面积

心梗后14,28 d,Masson染色结果显示MI组小鼠心脏梗死面积明显高于sham组小鼠(P<0.05);而相比于MI组,MI+Evolo组小鼠心脏梗死面积明显下降(P<0.05,见图4)。

与sham组比较,*P<0.05,**P<0.01;与MI组比较,#P<0.05,##P<0.01

2.5 转录组测序结果中SIRT家族转录水平变化

分析转录组测序结果,Sirtuins家族中可见SIRT3、SIRT5、SIRT7在sham组和MI组之间的转录水平发生明显变化,其中,只有SIRT3在MI组和MI+Evolo组之间的差异具有统计学意义(P<0.05,见图5)。

与sham组比较,**P<0.01;与MI组比较,#P<0.05

2.6 依洛尤单抗预处理减少心梗小鼠心肌细胞凋亡

心梗后7 d,TUNEL检测结果显示,MI组小鼠心肌细胞凋亡相较于sham组明显增加,具体表现为心梗小鼠心肌组织TUENL染色细胞核阳性率升高(P<0.05,见图6)。依洛尤单抗预处理降低了心肌细胞的凋亡水平,具体表现为小鼠心肌组织TUENL染色细胞核阳性率下调(P<0.05,见图6)。

图6 依洛尤单抗预处理减少心梗小鼠心肌细胞凋亡(n=8)

2.7 依洛尤单抗预处理通过上调SIRT3水平减少心梗小鼠心肌细胞凋亡

心梗后7 d的Western blot结果显示,相较于sham组,MI组小鼠心肌组织中PCSK9表达明显升高,SIRT3表达明显降低,cleaved Caspase-9表达明显升高,提示MI组小鼠心肌细胞凋亡增加。依洛尤单抗预处理下调了心梗小鼠心肌组织中PCSK9的表达量,上调了SIRT3的表达量,并降低了心肌细胞的凋亡水平,具体表现为cleaved Caspase-9水平下降(P<0.05,见图7)。

与sham组比较,*P<0.05,**P<0.01;与MI组比较,#P<0.05,##P<0.01

2.8 依洛尤单抗预处理通过上调SIRT3水平减少缺氧处理的原代心肌细胞凋亡

缺氧处理3 h,原代心肌细胞Western blot结果和流式细胞仪检测结果显示,与Con组相比,缺氧组原代心肌细胞的PCSK9表达明显升高,SIRT3表达明显下降,cleaved Caspase-9表达明显升高且心肌细胞凋亡率明显上升(P<0.05,见图8),提示缺氧组原代心肌细胞凋亡增加。依洛尤单抗预处理下调了缺氧处理的原代心肌细胞中PCSK9表达量,上调了SIRT3表达量,并降低了原代心肌细胞的凋亡水平,具体表现为cleaved Caspase-9表达下调、心肌细胞凋亡率下降(P<0.05,见图8)。

2.9 si-SIRT3可逆转依洛尤单抗预处理对缺氧原代心肌细胞凋亡的抑制作用

为了验证依洛尤单抗是否通过SIRT3改善心梗小鼠心脏收缩功能,本研究分离原代心肌细胞并用si-SIRT3干扰SIRT3的表达进行了体外细胞实验。原代心肌细胞缺氧处理3 h,结果显示,相比于Con组,缺氧组原代心肌细胞中PCSK9表达上升,SIRT3表达下降,cleaved Caspase-9表达升高(P<0.05,见图9),提示缺氧引起原代心肌细胞凋亡增加。依洛尤单抗预处理明显下调了缺氧处理的原代心肌细胞中PCSK9表达量,上调了SIRT3表达量,减少了缺氧引起的原代心肌细胞凋亡(P<0.05,见图9)。相较于hypoxia+Evolo组,hypoxia+Evolo+si-SIRT3组原代心肌细胞PCSK9表达量未见明显变化,SIRT3表达量明显降低,同时cleaved Caspase-9表达升高(P<0.05,见图9)。结果表明,si-SIRT3可以逆转依洛尤单抗预处理对缺氧原代心肌细胞凋亡的抑制作用。

与Con组比较,**P<0.01;与缺氧组比较,##P<0.01;与hypoxia+Evolo组比较,&&P<0.01

心肌梗死发生后,冠脉血流的突然中断或减少引起心肌细胞死亡或功能障碍[23]。心肌梗死后心肌细胞凋亡和心肌纤维化是不良心肌重塑的重要病理特征,也是导致心力衰竭的主要原因[6,7]。心肌梗死后心力衰竭以缺氧引起心肌细胞死亡和存活心肌细胞出现功能障碍为主要特征[23,24]。因此,本研究聚焦于减少心梗后心肌细胞凋亡和改善心梗后心脏收缩功能,针对性提出了治疗方案。

近年来研究表明,PCSK9具备不依赖于LDL受体的多效性作用,相应的,PCSK9单抗同样具备降脂作用以外的多效性。PCSK9单抗能够改善血管内皮功能、缓解血管壁炎症、减少心梗后梗死面积[22,25,26]。本研究首先明确了小鼠心梗后心肌组织中PCSK9表达情况,发现心梗后小鼠心肌组织中PCSK9蛋白表达明显增加。据此,本研究采用临床广泛应用的依洛尤单抗行小鼠心梗前预处理,以探讨依洛尤单抗对心梗小鼠心肌组织中PCSK9表达的作用,以及对心梗小鼠心脏功能和心脏梗死面积的作用。实验结果显示,依洛尤单抗预处理后,心梗小鼠心肌组织中PCSK9蛋白表达下调,心脏收缩功能改善,心脏梗死面积减小。该结果与既往研究保持一致[17,22]。

依洛尤单抗预处理对小鼠心梗后心衰改善作用的具体机制尚未完全清楚,本研究取小鼠心室肌组织行转录组测序发现,MI组相较于sham组,Sirtuins家族中可见SIRT3、SIRT5、SIRT7的转录水平发生明显变化,其中,只有SIRT3在MI组和MI+Evolo组两组之间的差异具有统计学意义。以sham组小鼠为参照,MI组和MI+Evolo组小鼠心肌组织中SIRT3表达均下调,但是,MI+Evolo组小鼠比MI组小鼠心肌组织中SIRT3下降幅度小,SIRT3表达量为MI组的2倍左右,提示依洛尤单抗预处理对心梗小鼠心脏收缩功能的改善作用可能为SIRT3依赖的。

Sirtuins家族为NAD依赖性的组蛋白去乙酰化酶,属于第三类组蛋白去乙酰化酶,在调节细胞代谢、转导胞内信号、衰老等众多生理过程中发挥重要作用。SIRT3定位于线粒体膜上,通过对赖氨酸可逆性去乙酰化,广泛参与线粒体功能、生物合成、糖代谢、脂代谢、氧化应激和凋亡等多种生理过程的调节[27]。既往研究表明,SIRT3与细胞凋亡密切相关。SIRT3通过作用于超氧化物歧化酶2(SOD2)、异柠檬酸脱氢酶2(IDH2)等底物显著增强细胞清除胞内ROS的能力[28,29],并通过作用于Opa1、Ku70、环孢素D等底物抑制细胞凋亡[30-32]。此外,在心衰的发病过程中,SIRT3也发挥着重要作用。心衰小鼠心肌组织中SIRT3表达水平下降[33]。上调SIRT3可通过抑制TGF-β/Smad3信号通路而抑制心肌纤维化,延缓心脏重塑,改善心脏功能[34]。近年来,SIRT3被视为心衰治疗的重要靶点[35]。本研究结果显示,心梗小鼠心肌组织中SIRT3蛋白表达下降,心肌细胞凋亡增加。依洛尤单抗预处理上调了心梗小鼠心肌组织中SIRT3表达水平,并降低了心梗小鼠心肌细胞凋亡水平。原代心肌细胞缺氧前给予依洛尤单抗预处理,上调了缺氧原代心肌细胞中SIRT3的表达量,缓解了缺氧诱导的原代心肌细胞凋亡。为了明确依洛尤单抗预处理对小鼠心梗后收缩功能的改善是否通过SIRT3而发挥作用,在体外原代心肌细胞实验中,用si-SIRT3抑制原代心肌细胞SIRT3蛋白表达后,再行原代心肌细胞缺氧前依洛尤单抗预处理。实验结果显示,抑制原代心肌细胞SIRT3蛋白表达后,逆转了依洛尤单抗预处理减少缺氧原代心肌细胞凋亡的作用。

本研究存在一定的局限性。其一,心梗后心衰的病理生理机制十分复杂,依洛尤单抗预处理可能通过作用于其他分子发挥其心梗后心功能改善作用,但至少在本研究中证实其部分作用是通过激活SIRT3发挥的;其二,依洛尤单抗预处理通过何种方式上调SIRT3表达及其具体的分子调控机制尚未明确,课题组正在进行相关研究。

总而言之,本研究证明,依洛尤单抗在心梗手术前预处理可以改善小鼠心梗后心脏收缩功能,降低小鼠心梗后心脏梗死面积,并通过转录组测序发现了新的作用机制,依洛尤单抗预处理对小鼠心梗后心衰的缓解作用很可能是通过激活SIRT3表达、降低心肌细胞凋亡水平而发挥的。本研究为临床急性心梗患者应用依洛尤单抗的安全性和有效性提供了实验证据,也为临床急性心梗患者早期启用依洛尤单抗提供了实验参照。