C57BL/6J小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎模型建立的关键性问题

方案中会采用CFA降低机体对抗原的破坏以延迟机体对抗原的免疫耐受，同时促进抗原的弥散，从而使抗原对机体缓慢持续的发挥免疫原性[11]。相对于易感大鼠，小鼠对诱导EAE相对抵抗，主要体现在发病率以及发病时间的差异，因此需要佐剂辅助。此外，CFA可增加EAE模型血脑屏障（Blood Brain Barrier，BBB）的通透性和中枢神经系统血管周围血清蛋白渗出[12]。结核分枝杆菌在EAE模型的诱导中主要通过激发T细胞介导的免疫反应来扩大免疫效应并引起淋巴结增生[13]。

乳化于完全弗氏佐剂的中枢神经系统不同特异性抗原在不同实验动物上诱导多种EAE，常见的抗原包括髓磷脂碱性蛋白（MBP）、蛋白脂质蛋白质（PLP）、髓鞘相关糖蛋白（MAG）和MOG，C57BL/6J小鼠是具有EAEsusceptible特性的品系之一，其对MOG的敏感抗原表位是3555位氨基酸[14]，其致敏的主要抗原是MOG3555多肽（MEVGWYRSPFSRVVHLYNGK）。

MOG3555抗原油包水乳剂的配制首先将MOG3555多肽15 mg加入生理盐水75 mL混匀为A液（每100 μL液体含MOG3555200 μg），将结核杆菌粉末30 mg加入完全弗氏佐剂（TB 1 mg/mL）75 mL中混为B液（每100 μL含结核杆菌500 μg），采用玻璃注射器吸取A液和B液后反复用力抽打2个小时以上充分乳化至将抗原油包水乳剂滴可以在清洁水面聚集而不分散并保持小球状。见图1。

13百日咳毒素溶液的配制早期的研究显示，当用小鼠脊髓匀浆组织溶于完全弗氏佐剂中来诱导EAE模型时，百日咳毒素可以增加模型的成功率和加重神经功能损伤症状[15]。后来的研究显示百日咳毒素能破坏血脑屏障，防止自身反应T细胞抗原产生，刺激抗原呈递细胞（APCs），不可逆地抑制第二信使和影响信号通路[16]，所有的这些结果都在解释百日咳毒素帮助诱导EAE模型的可能机制。将百日咳毒素采用生理盐水稀释成01 mL含400 ng百日咳毒素的溶液。

2免疫操作

21C57BL/6J小鼠麻醉麻醉是保障动物福利的重要内容之一，也是动物实验的一项重要基本技术[1718]。实验动物麻醉是保证实验成功的一个重要环节，采用安全、有效、适宜的麻醉方法以达到良好的麻醉效果是保证实验安全性、数据可靠性的重要基础。影响动物麻醉效果的因素主要包括麻醉剂的种类、浓度、剂量和给药方式。一项针对乌拉坦、阿佛丁和水合氯醛对C57BL/6J小鼠的麻醉研究证明[19]，使用乌拉坦则麻醉效果差、死亡率高，以合适剂量注射阿佛丁或水合氯醛（4%水合氯醛以020 mL/20 g）对C57BL/6J小鼠的麻醉时可以达到起效时间短、维持时间适中、死亡率低的效果。水合氯醛是在动物实验中具有良好效果和安全性保证的一种麻醉药[4]，具有性价比高、麻醉诱导快、术后苏醒快、死亡率低等优点[20]。一项水合氯醛对C57BL/6J小鼠麻醉研究表明，选择水合氯醛（25%水合氯醛以010 mL/10 g）腹腔注射麻醉C57BL/6J小鼠就可以诱导浅麻状态[21]。MOG3555诱导C57BL/6J小鼠皮下注射抗原油包水乳剂过程中诱导至浅麻状态即可，因此，建议使用25%水合氯醛以010 mL/10 g腹腔注射进行麻醉。

22皮下注射部位建立EAE模型抗原油包水乳剂给予部位主要有后肢足掌、尾部和侧腹皮下，其临床病程、高峰期、最高临床得分各不相同。C57BL/6J小鼠抗原给予部位均以侧腹皮下为主，其中蛋白脂蛋白（PLP）+CFA+百日咳毒素（PT）制成的抗原诱导慢性病程，高峰期为23～25 d；以髓脂质碱性蛋白（MBP）联合PLP+CFA+PT制成的抗原诱导也为慢性病程，高峰期为10～20 d；以MOG的抗原诱导为复发缓解病程，高峰期为14～20 d[2223]。由于抗原乳剂能够诱导强烈的炎性反应，甚至导致局部皮肤的肉芽肿和坏死，MOG3555诱导C57BL/6J小鼠注射抗原油包水乳剂建议在小鼠侧腹皮下分四点皮下注射共计02 mL MOG3555抗原乳剂。注射完抗原乳剂30 min后每只小鼠腹腔内注射01 mL（400 ng）百日咳毒素溶液，48 h后每只小鼠再次腹腔内注射1次01 mL（400 ng）溶液。

3免疫后护理

动物的福利考虑周全，其中对动物的优质护理能够很大程度上减少应激因素在动物实验中对实验结果准确性、可靠性的干扰[5]。其中动物麻醉中采取适当的水浴恒温垫保温措施，可以显著缩短麻醉周期和麻醉后恢复自主期的时间，减轻寒颤发生，增加动物舒适度，对辅助实验动物安全顺利苏醒有着重要的作用[24]。

免疫后小鼠由于强烈的炎性反应产生众多的免疫调节功能，小鼠出现激惹状态，建议减少单笼小鼠数量，并给予足量食物和水，否则弱小小鼠会被吃掉。免疫后3 d体质量缓慢下降，并伴有精神萎靡、皮毛不光滑、活动减少等特征，但是无运动功能障碍，随后体质量有所恢复。免疫第11天左右，伴随着出现体质量明显下降，小鼠逐渐依次出现尾部远端无力、尾麻痹、跛行、弓背、肢体瘫痪、濒死貌等症状，此时部分小鼠可以自行进食、饮水，多数小鼠进食、饮水比较困难，必须注意单笼饲养、食料及饮水嘴边放置、保温等精心呵护，必要时进行人工灌胃4次/d以防止其营养缺乏、脱水及水电解质紊乱等引起死亡，造模后死亡几乎全由免疫后护理不周全引起。

4结语

综上所述，EAE模型模拟人类MS或与人类MS极为相似的发病现象旨在有助于人们深入研究MS并探索合适的治疗方法。MOG3555诱导C57BL/6J小鼠EAE模型在病理学特点上与人类MS相似，在复发缓解型病程上可见脱髓鞘特征，组建MOG3555诱导C57BL/6J小鼠EAE模型的规范化流程弥补实验操作中的导致发病率不能达到100%和死亡率偏高的缺陷是进行MS研究和治疗的根基，其他研究工作都要围绕在均一性动物模型成功建立的基础上展开。因此，加强免疫前准备工作、免疫操作和免疫后护理3个方面的研究，分析EAE模型成功建立的关键性问题，对于其后一系列研究的成功有着重要意义。

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