[摘要] 目的 觀察错配修复MMR（Mismatch Repair）及Kras蛋白在子宫内膜病变中的表达，分析其MSI与Kras表达的意义及相关性。 方法 选取我院2014年1月～2017年12月子宫内膜病例共108例，用全自动免疫组化仪检测MMR及Kras。 结果 ①MMR失表达在内膜增生不伴非典型、增生伴非典型和内膜样腺癌组呈递增趋势。MLH1、MSH2和PMS2失表达在三组间差异有统计学意义（P<0.05），MSH6差异无统计学意义（P=0.189）。②内膜癌组MSI-H及MSI-L表型比率最高，在三组间差异有统计学意义（P<0.05）。③内膜癌组中MSI（Microsatellite instability）表型在不同年龄及肿瘤分化程度差异无统计学意义（P>0.05）。④Kras在三组病例表达呈递增趋势，组间差异有统计学意义（P<0.05）。⑤存在MSI的病例均伴有Kras表达，同时存在MSI及Kras表达的病例数量在增生伴非典型与内膜癌组间差异无统计学意义（P>0.05）。 结论 ①MSI及Kras可能是内膜癌进展的重要分子事件，与患者年龄、组织分化程度没有明显关系。②联合检测MMR及Kras蛋白可能有助于子宫内膜病变的诊断。
[关键词] 错配修复；MSI；Kras；子宫内膜
[中图分类号] R737.33 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2018）22-0107-04
[Abstract] Objective To observe the expression of Mismatch Repair（MMR） and Kras protein in endometrial lesions and analyze the significance and correlation of MSI and Kras expression. Methods A total of 108 cases with endometrial lesions from January 2014 to December 2017 in our hospital were selected. MMR and Kras were detected with an automated immunohistochemical apparatus. Results ①The loss of expression of MMR in the group of intimal hyperplasia without atypical lesions， hyperplasia with atypical lesions and endometrioid adenocarcinoma showed an increasing trend. The differences of the loss of expression of MLH1， MSH2， and PMS2 were statistically significant among the three groups（P<0.05）. The difference in MSH6 was not statistically significant（P=0.189）. ②The ratio of MSI-H and MSI-L phenotype in the endometrial cancer group was the highest， and there was a significant difference between the three groups（P<0.05）. ③There was no statistically significant difference in MSI（Microsatellite instability） phenotype at different ages and tumor differentiation levels in the endometrial cancer group（P>0.05）. ④The expression of Kras in three groups showed an increasing trend， and the difference between the groups was statistically significant（P<0.05）. ⑤The cases with MSI were all combined with Kras expression. The number of cases with MSI and Kras expression was not significantly statistically different between intimal hyperplasia with atypical lesions group and endometrial cancer group（P>0.05）. Conclusion ①MSI and Kras may be an important molecular events in the progression of endometrial carcinoma， and there is no significant relationship between the age and the degree of tissue differentiation of the patients. ②Combined detection of MMR and Kras protein may contribute to the diagnosis of endometrial lesions.
[Key words] Mismatch Repair（MMR）； MSI； Kras； Endometrium
子宫内膜不典型增生是一种癌前病变[1]。2014 WHO女性生殖器官肿瘤分类将内膜增生性病变简化成增生不伴非典型及伴非典型两大类。判断内膜是否存在非典型成为诊断的重点和难点[2]。
错配修复基因（Mismatch repair genes）是一组极其保守的看家基因，负责检查并纠正碱基错配，包括MLH1、MSH2、PMS2和MSH6等。MMR突变会引起微卫星不稳定性（Microsatellite instability，MSI），使基因组不稳定、癌基因及抑癌基因发生变化，导致肿瘤发生[3]。
Kras基因存在于女性生殖系统及呼吸系统等恶性上皮肿瘤中，这些肿瘤均检测出持续的Kras基因突变。Kras一旦突变，将处于持续激活状态，引发肿瘤细胞无序增殖。
本研究用免疫组化法检测子宫内膜病变MMR及Kras蛋白的表达，探讨它们的MSI和Kras蛋白表达的意义及两者间的相关性。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取2014年1月～2017年12月赣州市肿瘤医院子宫内膜病例108例，分为内膜增生不伴非典型30例、增生伴非典型30例、子宫内膜样癌（Ⅰ型）48例。内膜癌组32～70岁，32～40岁4例，41～50岁20例，51～60岁19例，61～70岁5例，平均（50.00±7.78）岁。所有标本由两名主治以上病理医师复核，根据2014版 WHO女性生殖器官肿瘤分类标准[4]，将内膜癌分为子宫内膜样癌（Ⅰ型）以及非子宫内膜样癌（Ⅱ型），挑选出子宫内膜样癌（Ⅰ型）病例共48例，根据其分化程度分为高分化（n=15）、中分化（n=22）、低分化（n=11）。对照比较三组一般资料，差异不明显（P>0.05），具有可比性。
1.2 仪器和试剂
仪器为罗氏诊断产品有限公司的全自动免疫组化仪BenchMark-XT。MLH1、MSH2、PMS2和MSH6即用型抗体均购自福州迈新试剂有限公司；Kras浓缩抗体购自武汉三鹰试剂有限公司（Kras以1∶300浓度稀释后使用）；optiview DAB购于罗氏诊断产品有限公司。
1.3实验方法
采用罗氏诊断BenchMark-XT全自动免疫组化仪进行染色。将所选组织均制成3 μm的石蜡薄片并裱于防脱玻片上，充分烤片后置入全自动免疫组化仪。把optiview DAB放在试剂架后运行仪器，中途手动滴加一抗。待运行完毕后清洗切片，脱水封片以及镜检。
1.4 观察指标与评定标准
MLH1、MSH2、PMS2和MSH6蛋白表达均定位在细胞核和细胞质中，以切片中非肿瘤内膜间质及淋巴细胞对照，细胞核和细胞质呈棕褐色为阳性表达，无着色则为阴性。
MSI评定：微卫星稳定（Microsatellite stability，MSS）为4个MMR阳性；低频度微卫星不稳定（Low level of microsatellite instability，MSI-L）为仅有1个MMR失表达；高频度微卫星不稳定（High level of microsatellite instability，MSI-H）为≥2个MMR失表达[5]。
Kras蛋白以肺癌组织对照，10%以上的细胞胞质见淡黄或棕色表达为阳性[6]。
1.5 统计学处理
应用SPSS20.0统计学软件对数据进行处理。计数资料采用χ2检验，相关性分析采用Spearman相关分析。P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 MMR蛋白表达情况
MMR失表达率在内膜增生不伴非典型、增生伴非典型和内膜样腺癌组呈递增趋势。内膜癌以MLH1和PMS2失表达为主。MLH1、MSH2和PMS2失表达率在三组间差异有统计学意义（P<0.05）；MSH6在三组间差异无统计学意义（P=0.189）。见表1、封三图5、6。
2.2 MSI表型情况
内膜癌的MSI-H及MSI-L表型比率均高于另外两组，在三组中呈递增趋势，且两两间差异均有统计学意义（P<0.05）。见表2。
2.3 子宫内膜样腺癌MSI与临床特征的关系
MSI表型在≤50岁与>50岁组间差异无统计学意义（P=0.649）；在不同分化程度组间差异也无统计学意义（P=0.271）。见表3。
2.4 Kras蛋白表达情况
Kras在三组病例中表达呈递增趋势，组间差异有统计学意义（P<0.05）。见表4、封三图7。
2.5 MSI与Kras表达的相关性
具有MSI（包括MSI-H和MSI-L）的病例均伴有Kras表达。Kras阳性病例中，MSI表型比率在增生伴非典型及内膜癌组中相似，组间差异无统计学意义（P=0.703）。追踪本研究中内膜增生伴非典型病例，发现3例伴有局灶癌变，且这3例病例同时存在MSI及Kras表达。见表5。
所有子宮内膜病例的MSI情况和Kras表达经Spearman秩相关分析，r值为0.597，为中度相关，P值=0.00，相关性显著。见表6。
3讨论
3.1 MMR蛋白失表达的意义
MMR反应的主体是其编码翻译的MMR蛋白，hMSH2与 hMSH6聚合成二聚体hMutS-α，hMLH1与hPMS2聚合成二聚体hMutL-α，hMutS-α识别发生碱基错配的区域，hMutL-α辨别存在错配的新生成的DNA链。二者共同联接到错配的区域，启动修复反应，将错配的DNA片段切除，并合成新的DNA。MMR系统的相互协调作用在反应过程中极其关键，任何一种产物功能异常将引起MMR功能异常[7]。
子宫内膜细胞DNA复制频率高，碱基错配可能性大，相应MMR基因突变概率也较高。研究表明内膜增生伴非典型患者进展为癌的概率为20%～52%[8]，其中28%增生伴非典型及内膜癌病例都存在MSI，推测它们可能有类似的分子生物学途径，且在高分化内膜样腺癌常见[9]。赵岩等[10]研究22例内膜非典型增生有2例存在MSI，这2例经证实有局灶癌变。
本研究中MSI存在于子宫内膜病变中，内膜癌组MSI比率显著高于另外两组，提示MMR失表达引发的MSI可能是内膜增生性病变发展为内膜癌的重要分子事件。且MSI与患者年龄、肿瘤分化程度无明显关系，与大多数研究结果一致。
3.2 Kras蛋白表达的意义
Kras基因为原癌基因，位于EGFR信号通路下游，其表达产物p21ras蛋白构型因Kras激活而改变，与GTP紧密结合后始终处于活化状态，持续激活下游信号转导，影响Ras/Raf/MEK/ERK/MAPK 细胞转导通路的调控功能[11]。该信号通路一旦失控，将引发瘤细胞快速增殖、异常分化及血管形成，同时抑制肿瘤凋亡[12]。
Ⅰ型内膜癌Kras突变率远高于Ⅱ型，且Kras在内膜良性病变中无表达，在增生伴非典型和内膜癌中均有表达[13]。众多研究显示Kras广泛表达于子宫内膜癌和癌前病变，在增生伴非典型与高分化内膜癌组间无明显差异[14-16]，同时提出Kras检测在内膜癌的初诊和预后评估工作中意义重大[17]。
本研究中Kras表达率在增生不伴非典型、伴非典型和内膜癌组呈递增趋势，与多数学者的报道相符。内膜癌组表达率显著高于另外两组，提示Kras可能是引发内膜癌的重要分子事件，在其发展过程中起关键作用。Kras高表达于大部分内膜癌中，表达强度相似，推测其表达程度与分化程无明显关系，与部分学者[14]报道的Kras表达程度及强弱与内膜癌的分化程度相关不符，可能与参与实验的病例差异及选取的 Kras抗体不同有关。Kras在三组病例中均有表达，无法单纯通过检测Kras来鉴别诊断。本研究采用免疫组化法检测Kras，体现的是Kras蛋白表达情况，结构类似的蛋白都可能表达，使本实验Kras表达率较高，并不能完全代表所检组织Kras基因的真实情况。建议后续实验可用PCR法检测内膜病变组织Kras基因突变情况，并将结果与本实验结果对比、分析。
3.3 联合MMR与Kras蛋白检测的意义
子宫内膜癌发生需经过MSI、PTEN、Kras和β-catencin基因突变4种分子学变化，MSI引起癌基因和抑癌基因突变、效果增聚，后三者突变则影响细胞信号传导通路，最终导致肿瘤发生[18]。文献报道，散发性内膜癌MSI和Kras突变率分别为25%～30%及10%～30%，Kras突变常发生于存在MSI的肿瘤。本研究中存在MSI的病例均伴Kras表达，且增生伴非典型和内膜癌组中同时存在MSI及Kras表达的病例比率相似，其差异无统计学意义。这也许表明MSI和Kras在增生伴非典型和内膜癌中同等重要，二者同时表达提示病变恶化。MSI与Kras蛋白表达的相关性分析提示，两者具有一定的相关性，在MSI的病例中，Kras蛋白阳性可能性大，在MSS的病例中，Kras蛋白阴性的可能性大。此外30例增生伴非典型的病例中发现3例局灶癌变，经证实这3例病例均有MSI和Kras表达。这也许提示内膜增生中，若同时发现MSI和Kras表达，其伴有非典型且癌变的概率可能大于无MSI和Kras表达的病例。本研究中此类病例数较少，无法充分证实此推论，建议后续实验加大不典型增生合并癌变的病例数，进一步探讨上述推論是否成立。
综上所述，内膜增生性病变难以鉴别其非典型或癌变时，MMR及Kras蛋白的共同检测，可能有助于协助诊断，并及早给予患者相应治疗，最终达到提高内膜癌患者生活质量及生存率的目的。
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（收稿日期：2018-04-03）
