苍柏湿毒清及其拆方对解脲支原体感染小鼠IL—12影响

材料

11实验对象

雌性BALB/c小鼠，清洁级，7周龄，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于北京中医药大学东方医院实验中心动物实验室。

12主要试剂、仪器

解脲支原体血清4型（美国模式培养物集存库）；苯甲酸雌二醇（天津金耀氨基酸有限公司）；解脲支原体液体培养基（珠海丽珠试剂有限公司）；小鼠IL-12 ELISA试剂盒（美国R&D公司）；酶标仪MULTISKAN MK3（Thermo）；切片机RM2016（德国徕卡）；中草药（北京中医药大学东方医院草药房）。

13中药组成及剂量

苍柏湿毒清组药物由炒苍术10g、黄柏10g、土茯苓15g、虎杖10g、白头翁10g、马齿苋15g、生薏苡仁30g、生黄芪10g、苦参10g、茯苓15g、白扁豆10g、马鞭草10g、白花蛇舌草15g、败酱草15g、丹参15g、柴胡10g组成，每剂210g；活血利湿组药物由丹参15g、败酱草15g、虎杖10g、马鞭草10g组成，每剂50g；清热解毒组药物由黄柏10g、土茯苓15g、白头翁10g、马齿苋15g、白花蛇舌草15g、败酱草15g、虎杖10g、马鞭草10g、苦参10g、柴胡10g组成，每剂120g；健脾利湿组由苍术10g、生薏苡仁30g、生黄芪10g、茯苓15g、白扁豆10g组成，每剂75g。

中草药由北京中医药大学东方医院制剂室制备成浓缩2g/mL浓度药液。

2实验方法

2.1动物分组

按随机数字表将60只BALB/c小鼠随机分成六组，即苍柏湿毒清组、活血利湿组、清热解毒组、健脾利湿组、模型组、空白组，每组10只。

2.2操作步骤

2.2.1菌液复苏与传代将解脲支原体血清4型冻干菌株用解脲支原体液体培养基1mL溶解稀释，用移液器吸取其中02mL培养基放于18mL解脲支原体液体培养基中，然后倍比稀释10次，置于37℃恒温培养箱中培养48h。对培养基进行PH值检测，选取PH为65±05的培养基，然后传代，传至第三代时配制成105CCU/mL的浓度备用。

2.2.2动物造模＼[7＼]每周在苍柏湿毒清组、活血利湿组、清热解毒组、健脾利湿组、模型组小鼠的皮下注射1次苯甲酸雌二醇注射液02mL，连续4周。第2次皮下注射雌二醇后，用无菌输液软管向以上BALB/c小鼠阴道注入预备的标准株菌液20μL，每天1次，连续3d。第4次注射完雌二醇后，取小鼠阴道分泌物检测解脲支原体，放入解脲支原体液体培养基，在37℃条件下培养。若培养基颜色变红即表明支原体检测阳性，造模即成功。

2.23中药灌胃小鼠平均体重为20g，用药量为成人剂量的6倍。按成人平均体重为60kg计算，苍柏湿毒清组每天剂量0105mL；活血利湿组每天剂量0025mL；清热解毒组每天剂量00525mL；健脾利湿组每天剂量00375mL；中药灌胃，每天2次，间隔6h，连续7d。

2.3样品检测＼[8＼]

药物干预结束后2d，采用空气静脉栓塞处死BALB/c小鼠，立即用解剖刀和剪解剖会阴部，摘取阴道黏膜组织。加入500μL PBS溶液，匀浆。将组织匀浆液离心，采用ELISA法对上清液进行IL-12的定量检测。

2.4数据处理

应用SPSS 200统计软件，P<005为差异有统计学意义。

3实验结果

3.1一般情况

BALB/c小鼠注射苯甲酸雌二醇注射液后出现不同程度的竖毛、精神不振、进食减少。接种解脲支原体后小鼠外阴分泌物多、红肿；模型组小鼠外阴有明显溃疡、糜烂，伴黄色脓液；治疗后苍柏湿毒清组及健脾利湿组BALB/c小鼠外阴分泌物较之前减少。空白组BALB/c小鼠明显较其它组小鼠活动活跃，毛色光滑，阴道无红肿溃疡。

实验过程中，模型组-9 1只小鼠死亡，考虑注射雌二醇操作不当致死。空白组-1、空白组-4，2只小鼠不明原因死亡。活血利湿组-2、模型组-6，2只小鼠死亡，考虑为解脲支原体严重感染所致。苍柏湿毒清-1、苍柏湿毒清-7、清热解毒组-6、健脾利湿组-2，4只小鼠因灌胃操作不当呛咳死亡。

3.2阴道黏膜IL-12值

对各组数据进行Shapiro-Wilk正态性检验，苍柏湿毒清组、活血利湿组、清热解毒组、健脾利湿组、模型组、空白组的P值分别是0760、0892、0650、0776、0216、0814（P>005），均服从正态分布。

各组数据进行方差齐性检验，Levene统计量为1194，P值0327，认为六组方差齐性；对多组均数比较，采用单因素方差分析，F值为3952，P值为0005，六组BALB/c小鼠阴道黏膜组织IL-12不全相等，可以进行组间比较。

六组BALB/c小鼠阴道黏膜组织IL-12由高到低依次是模型组、清热解毒组、活血利湿组、健脾利湿组、苍柏湿毒清组、空白组。见表1。

表1各组BALB/c小鼠阴道黏膜IL-12均值组别数量均值±标准差（ng/L）苍柏湿毒清组87719±3944*活血利湿组910128±3602△清热解毒组911034±2988△健脾利组88757±2957*模型组812471±2547△空白组86662±2189*注：与模型组比较，*P<005；与空白组比较，△P<005

采用LSD检测法，模型组分别与健脾利湿组、苍柏湿毒清组、空白组进行组间两两比较，P值分别为0018、0004、0001。清热解毒组分别与苍柏湿毒清组、空白组进行组间两两比较，P值为0033、0006，差异有统计学意义。空白组与活血利湿组进行组间比较，P值为0026，差异具有统计学意义。苍柏湿毒清组、健脾利湿组、空白组组间两两比较，差异无统计学意义；活血利湿组、清热解毒组、模型组组间两两比较，差异无统计学意义。

实验表明UU感染后BALB/c小鼠阴道黏膜组织的IL-12呈高水平。苍柏湿毒清组、健脾利湿组可降低阴道黏膜组织IL-12的高水平，使之趋于正常水平。

实验结论：苍柏湿毒清及健脾利湿类药物可降低解脲支原体感染小鼠阴道黏膜组织IL-12的高水平，可能是通过调节IL-12水平，以降低血管通透性，减少炎症渗出，保持阴道黏膜屏障完整，从而在治疗解脲支原体感染中发挥重要作用。

4讨论

IL-12，属白细胞介素中的一种，是目前已知对细胞免疫活性诱导和调节作用最强的多功能细胞因子。IL-12由单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞等抗原呈递细胞产生，其中尤以树突状细胞为主。IL-12对多种免疫细胞有调控作用，如可刺激自然杀伤细胞生长，产生干扰素-γ＼[9＼]；增强细胞毒性淋巴细胞的细胞毒活性；促进Th0向Thl分化进而激活细胞毒T细胞（cTL），促发Thl类细胞因子的产生、抑制Th2类细胞因子产生，促发以细胞免疫反应为主、体液免疫为辅的免疫反应类型，以适应机体对肿瘤、病毒及胞内寄生菌的攻击＼[10＼]。

慢性肝病患者乙型肝炎病毒（HBV）复制水平与IL-12表达水平呈正相关关系。对慢性乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化患者进行血清IL-12检测，结果表明慢性乙型肝炎、肝炎肝硬化组血清IL-12水平明显高于对照组（P<005）；慢性乙型肝炎、肝硬化患者HBV-DNA高复制组（HBV-DNA>105·mL-1）血清IL-12表达水平明显高于HBV-DNA阴性组（HBV-DNA<103·mL-1）（P<005）＼[11＼]。吴亚斌等＼[12＼]进行了相似研究，慢性乙型肝炎患者血清IL-12水平高于对照组（P<001）；慢性乙型肝炎重度患者血清IL-12水平较轻中度患者显著增高（P<001）。HBV复制程度越活跃，慢性肝病患者IL-12表达水平越高。同HBV感染相似，感染苍白螺旋体后，患者血清IL-12亦呈动态变化。对早期患者血清IL-12水平进行检测，一期梅毒患者IL-12水平与治疗有效的患者及正常组之间差异无显著性（P>005）；二期梅毒患者及早期潜伏梅毒患者血清IL-12水平低于正常组、一期梅毒患者及治疗有效患者（P<005）。一期梅毒时IL-12水平未降低，可刺激Th1细胞增殖，维持细胞免疫；当进入二期梅毒时患者血清IL-12水平降低，可导致Th1细胞减少，细胞免疫抑制，不能清除苍白螺旋体，使疾病慢性发展＼[13＼]。苍白螺旋体越活跃，梅毒患者血清IL-12水平越高。

HBV病毒的活跃与病毒内的DNA复制有关。HBV由双层衣壳和核心组成，核心部分含有环状双股DNA和具有逆转录酶活性的DNA聚合酶＼[14＼]。HBV进入肝细胞内，脱去衣壳，核心内的DNA进入肝细胞核。在DNA多聚酶的作用下，DNA进行复制、转录、翻译，核心包裹衣壳后完成病毒体的复制。苍白螺旋体是原核生物，遗传物质是DNA。苍白螺旋体属螺旋体科密螺旋体属，其基本结构和生物学性状与细菌相似，有细胞壁及核质＼[15＼]；生活周期分为颗粒期、球形期、螺旋体期。苍白螺旋体的发育周期与梅毒的周期、慢性病程、发病程度有关，即苍白螺旋体内DNA复制越活跃，梅毒发展越迅速，病情越不稳定。UU是介于细胞与病毒之间的原核微生物，同HBV及苍白螺旋体相同遗传物质为DNA。UU的繁殖速度与DNA活跃程度密切相关，UU繁殖速度越快，DNA复制程度越活跃。UU内大量DNA复制可刺激细胞免疫，刺激Th1细胞、自然杀伤细胞增多，增殖的Th1可导致IL-12水平升高。本实验中模型组小鼠阴道分泌物明显比其他组小鼠阴道分泌物多，且伴有局部黏膜出现溃疡、糜烂，为UU大量繁殖的结果。感染UU后小鼠细胞免疫增强，增殖的Th1细胞可大量产生干扰素-γ、IL-12等细胞因子，导致炎症明显，使得外阴糜烂、渗出。苍柏湿毒清及健脾利湿类药物通过调节免疫，抑制UU内DNA的复制，导致IL-12水平恢复正常，局部黏膜炎症减轻。

参考文献

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（收稿日期：2014-08-14）