林爽，王杰，高珊珊，周永康，程立伟，吉艳慧
（1.北京康仁堂药业有限公司，北京 101301；
2.中药配方颗粒关键技术国家地方联合工程研究中心，天津 301700；
3.北京市中药配方颗粒工程技术研究中心，北京 101301）
龙血竭（resina dracaenis，RD）是我国珍稀名贵中药材，为百合科剑叶龙血树含脂木材提取得到的树脂，主产于云南、广西[1]，素有“活血圣药”之称[2]。龙血竭主要化学成分有黄酮类、酚类、萜类、甾体及苷类、酯类和二苯乙烯类等[3]；
其中黄酮类为其主要的活性成分[4-6]，其代表成分有龙血素A、龙血素B及7,4’-二羟基黄酮[7]等；
具有二苯乙烯的母核结构的化合物代表有白藜芦醇及紫檀茋[8]，常作为控制龙血竭药材质量的指标性成分。龙血竭在临床上外用具有止血生肌、止痛等作用，内服具有活血祛瘀、定痛等功效[9]。现代药理表明，龙血竭具有抗肿瘤[10-11]、抗炎[12-13]、保护心血管[14-15]、活血止血[16-18]、镇痛[19]等作用。
2020年版《中华人民共和国药典》[20]未收录龙血竭，仅收录复方龙血竭胶囊，并只对龙血竭的石油醚提取物进行薄层鉴别；
含量测定项下对龙血素A和龙血素B的总含量进行了规定，未收录指纹图谱。龙血竭药材各地方标准基本一致，以《贵州省中药材民族药材质量标准》（2003年版）[21]为例，薄层鉴别与含量测定项的供试品制备均操作复杂，给龙血竭的定性与定量分析造成较大困难。本研究建立薄层色谱（TLC）法，并以超高效液相色谱（UPLC）法建立特征图谱，同时通过化学计量学深入分析研究影响龙血竭质量的主要成分群以评价龙血竭质量，旨在为龙血竭的质量控制提供参考。
Waters UPLC H-Class Plus超高效液相色谱仪（配备PDA检测器）、Empower 3工作站、BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）（美国沃特世公司）；
MSA6.6S.0CE-DM型电子天平（d=0.001 mg）（德国赛多利斯公司）；
ML204T型电子天平（d=0.000 1 g）（瑞士梅特勒托利多公司）；
KQ-100DE型超声波清洗器（昆山市超声仪器公司）；
GOODLook-1000型薄层成像系统（上海科哲生化科技有限公司）；
硅胶G薄层板（烟台市化学工业研究所）。
白藜芦醇（批号：111535-201703，纯度：99.4%）、7，4’-二羟基黄酮（批号：111787-201002，纯度：98.6%）、龙血素B（批号：111558-201407，纯度：99.9%）、龙血素A（批号：DST202101-119，纯度：99.97%）均购于成都德斯特科技有限公司；
紫檀茋（批号：P815984，纯度≥98.0%）购于北京迈瑞达科技有限公司；
龙血竭对照药材（批号：121252-201303）购于中国食品药品检定研究院；
乙腈、磷酸均为色谱纯，购于美国赛默飞世尔公司；
甲醇为分析纯，购于上海国药集团；
水为蒸馏水，购于广州屈臣氏公司。
收集的18批龙血竭药材为北京康仁堂定点采购的百合科植物剑叶龙血树Dracaena cochinchinensis (Lour.) S.C.Chen.的树脂加工品，经北京康仁堂“中药传承工作室”工程师于立伟鉴定为正品龙血竭，编号分别为RD1～RD18，产地均为云南省，样品具体信息见表1。
表1 龙血竭样品信息
取0.5 g龙血竭药材粉末，加10 mL乙酸乙酯超声30 min，过滤，即得供试品溶液。另取龙血竭对照药材0.5 g，同法制得对照药材溶液。再分别取龙血素A、龙血素B对照品适量，加乙酸乙酯配制成每1 mL含1 mg的对照品溶液。参照2020年版《中华人民共和国药典》薄层色谱法（通则0502）试验，吸取以上各溶液3～8μL，点于同一块硅胶G薄层板上，以石油醚（60～90℃）-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇（15∶8∶2∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%磷钼酸乙醇溶液的显色剂，于105 ℃加热至斑点清晰，可见光下进行显色检视。结果显示，通过对18批龙血竭药材样品进行薄层鉴别，龙血素A、龙血素B斑点清晰，与其他条带分离良好，供试品色谱在与对照药材色谱和对照品色谱相应位置上显相同颜色的斑点。（见图1）
图1 18 批龙血竭TLC 色谱图
3.1 混合对照品溶液的制备 取白藜芦醇、7,4’-二羟基黄酮、龙血素A、龙血素B、紫檀茋对照品适量，精密称定，加甲醇配制成每1 mL分别含80、20、60、100、100 μg的混合对照品溶液，摇匀，即得。
3.2 供试品溶液的制备 取本品粉末（过三号筛）约0.2 g，精密称定，置50 mL锥形瓶中，精密加入甲醇20 mL，密塞，称定质量，超声处理10 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
3.3 色谱条件 采用Waters Acquity UPLCBEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色谱柱，以乙腈-0.1%磷酸水溶液进行梯度洗脱：0～5 min，15%～25%乙腈；
15～35 min，25%～30%乙腈；
35～50 min，30%～40%乙腈；
检测波长为280 nm；
体积流量为0.3 mL/min；
柱温为35 ℃；
进样量为3 μL。
3.4 指纹图谱的建立
3.4.1 共有峰确认及色谱峰指认 按“3.2”项下方法制备RD1～RD18供试品溶液，按“3.3”项下方法记录色谱图，进行对照品的比对，共标定16个共有峰。（见图2）指认出5个色谱峰[22]，分别为白藜芦醇、7,4’-二羟基黄酮、龙血素A、龙血素B、紫檀茋。（见图3）其中峰14（龙血素B）色谱峰分离较好，基线平稳，因此将龙血素B作为参考峰（S）峰。
图2 18 批龙血竭UPLC 指纹图谱色谱图
图3 龙血竭（RD1）与混合对照品UPLC 色谱图
3.4.2 指纹图谱相似度的评价 将获得的18批龙血竭色谱图导入到《中药指纹图谱相似度评价》（2012年版）中，以RD1为参照图谱，时间窗宽度为0.1，中位数为对照图谱的生成方法，以16个共有峰为Mark峰匹配的方式，得到对照图谱，计算RD1～RD18与对照图谱的相似度在0.980～0.996之间，说明建立的指纹图谱具有良好的一致性。
3.5 方法学验证
3.5.1 线性关系考察 取白藜芦醇、7,4’-二羟基黄酮、龙血素A、龙血素B、紫檀茋对照品适量，精密称定，加甲醇配制成每1 mL分别含324.68、65.62、252.48、426.92、25.392 μg的混合对照品溶液，作为线性1对照品溶液。精密量取线性1对照品溶液10.0、5.0、2.0、1.0 mL，分别置20 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，得线性2～5对照品溶液后，按“3.3”项下方法进样测定，以峰面积为纵坐标（Y），对照品浓度为横坐标（X），绘制标准曲线，考察结果见表2。
表2 龙血竭中5 种化学成分线性关系考察结果
3.5.2 精密度试验 按“3.2”项下方法制备RD1供试品溶液，按“3.3”项下方法连续6次，记录色谱图，结果峰1～峰16与S峰的相对保留时间RSD值为0.01%～0.56%，相对峰面积RSD值为0.18%～1.68%，白藜芦醇、7,4’-二羟基黄酮、龙血素A、龙血素B、紫檀茋的含量RSD值为0.25%～0.78%。表明仪器的精密度良好。
3.5.3 稳定性试验 按“3.2”项下方法制备RD1供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h，按“3.3”项下方法记录色谱图，结果峰1～峰16与S峰的相对保留时间RSD值为0.01%～0.25%，相对峰面积RSD值为0.10%～1.21%，白藜芦醇、7,4’-二羟基黄酮、龙血素A、龙血素B、紫檀茋的含量RSD值为0.22%～0.98%。表明供试品溶液在24 h内具有良好的稳定性。
3.5.4 重复性试验 按“3.2”项下方法制备RD1供试品溶液6份，按“3.3”项下方法记录色谱图，结果峰1～峰16与S峰的相对保留时间RSD值为0.01%～0.78%，相对峰面积RSD值为0.15%～1.95%，白藜芦醇、7,4’-二羟基黄酮、龙血素A、龙血素B、紫檀茋的含量RSD值为0.33%～1.02%。表明该方法具有良好的重复性。
3.5.5 加样回收率试验 取龙血竭样品（RD1）粉末6份，每份0.1 g，加入每1 mL分别含40.45、8.20、30.10、52.60、56.25 μg的白藜芦醇、7,4’-二羟基黄酮、龙血素A、龙血素B、紫檀茋混合对照品溶液20 mL，按“3.2”项下方法制备回收率样品溶液，按“3.3”项下方法进样测定，计算各成分的加样回收率和RSD值，结果平均回收率为98.64%～100.89%，RSD值均小于3%，表明该方法测得的结果准确。
表3 加样回收率试验结果（n=6）
续表3：
3.6 样品含量测定 按“3.2”项下方法制备18批龙血竭样品溶液，按“3.3”项下方法测定，计算其含量，见表4。
表4 18 批龙血竭中5 种化学成分含量测定结果（n=2）
4.1 聚类分析（cluster analysis，CA）以18批龙血竭的16个共有峰的峰面积为变量，应用SPSS 25.0软件进行数据Z标准化处理，并进行CA分析，采用组间联接、平方欧式距离的方法，得聚类分析结果。（见图4）当类间距离为15时，样品被分为三大类：RD1～RD10为Ⅰ类，样品来源于云南省普洱市和临沧市；
RD11～RD12和RD17～RD18为Ⅱ类，样品来源于云南省西双版纳傣族自治州；
RD13～RD16为Ⅲ类，样品来源于云南省西双版纳傣族自治州。提示龙血竭的质量与产地存在一定的关联，同时又存在其他影响龙血竭质量的因素，原因可能为剑叶龙血树生长年限差异或树脂加工方法不同。
图4 聚类分析结果树状图
4.2 主成分分析（principal component analysis，PCA）以18批龙血竭的16个共有峰的峰面积为变量，应用SPSS 25.0软件对数据进行Z标准化，并进行PCA分析，使用相关性矩阵的分析方法，得到总方差解释结果（见表5）。提取特征值大于1的结果，共有2个，累计旋转载荷平方和为91.596%，认为前2个主成分能够代表龙血竭绝大部分的质量信息。旋转后的成分矩阵（见表6），其中载荷的绝对值越大，对主成分的贡献越大，峰2（7,4’-二羟基黄酮）、峰4、峰7、峰6、峰1（白藜芦醇）、峰13（龙血素A）、峰14（龙血素B）在主成分1中有较高的载荷值，载荷值的绝对值均大于0.8；
峰10、峰12、峰8、峰16（紫檀菧）在主成分2中有较高的的载荷值，载荷值的绝对值均大于0.8，说明影响龙血竭质量的不止一个因素，可将影响质量的主要成分7,4’-二羟基黄酮、白藜芦醇、龙血素A、龙血素B及紫檀菧作为含量测定的指标性成分。
表5 总方差解释结果
续表5：
表6 主成分矩阵
4.3 综合评分计算 以18批龙血竭的16个共有峰的峰面积为变量，应用SPSS 25.0软件对数据进行Z标准化，得到Xi。由主成分分析得到成分得分系数a（见表6），由公式Fi=a1X1+a2X2+……+aiXi计算F1和F2，综合得分函数为F=F1×W1+F2×W2（W为成分载荷百分比）[23]。计算18批龙血竭样品的综合评分（见表7），其中F值越高，代表以提取到的主成分为指标的样品质量越好[24]。根据F值判断，聚类结果为Ⅱ类的样品质量最好，同时第Ⅱ类样品5种成分的含量总和亦是最高的，进一步验证了含量测定指标的选择对样品质量评价具有参考价值。
表7 龙血竭药材综合评分
续表7：
在TLC考察中，考察以硫酸乙醇溶液和磷钼酸乙醇溶液作为显色剂，在使用10%硫酸乙醇溶液时，色谱图中龙血素A呈粉红色斑点，龙血素B呈不清晰的淡黄色斑点；
在使用10%磷钼酸溶液时，色谱图中龙血素A、龙血素B分别呈现紫色和深蓝色斑点，两个对照品在色谱图中较好区分，同时供试品色谱图中其他的斑点显色清晰，与龙血竭对照药材色谱图中的斑点一致，因此选用以10%磷钼酸乙醇溶液作为显色剂。建立的该薄层鉴别方法，相较于贵州省中药材民族药材质量标准[21]，操作简单，色谱图显示的信息丰富，能快速达到对龙血竭药材的鉴别。
在UPLC法的研究中，建立了同时测定指纹图谱及含量测定的方法。指纹图谱能够表征龙血竭药材整体的质量，共确定了16个共有峰，指认出5个色谱峰；
鉴于龙血竭中的成分较为复杂，测定一两个成分往往具有局限性，故本研究同时对5种成分进行定量分析，较为全面地评价龙血竭的质量。与现行的贵州省中药材民族药材质量标准[21]比较，本研究增加了指纹图谱项，同时对除龙血素A和龙血素B为指标进行定量分析外，还将白藜芦醇、7,4’-二羟基黄酮、紫檀茋纳入定量指标，为龙血竭药材质量标准的制定与提升提供较为全面的参考。
从化学计量学结果看，收集的18批龙血竭样品质量存在差异。根据聚类结果可分为三大类，与产地具有一定的相关性。主成分分析提取出的2个主成分，能够代表龙血竭的大部分质量信息，同时根据各共有峰的载荷值，判断将白藜芦醇、7,4’-二羟基黄酮、龙血素A、龙血素B、紫檀茋定位含量测定指标的合理性。聚类结果与综合得分F值结果基本一致。因此，可根据指纹图谱与化学计量学结合的方式比较龙血竭的质量，根据F值判断，聚类结果为Ⅱ类的样品质量最好；
计算5种成分含量的总和，以第Ⅱ类的总含量最高，提示含量测定或能判断样品质量的优劣。因未收集到足够多的样品，未从18批云南产地的龙血竭中得出产地、加工方式的规律，今后的研究可加以补充其他品质的样品加以研究。
