肺泡灌洗液Xpert,MTB/RIF,联合血清TSPOT-TB在病原学阴性肺结核的诊断价值

李成行 李月翠 张莉莉 邱 帅 倪晓莉

肺结核是由结核杆菌引起的呼吸道传染疾病，主要临床表现为咳嗽、咳血、午后低烧、夜间可有盗汗、乏力、食欲减退、消瘦等[1]。肺泡灌洗液利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术（XpertMTB/RIF）是基于核酸扩增的一种半巢式荧光定量PCR 体外分子诊断技术，该技术可操作性、敏感性均较高，但操作中常因人为操作失误或样本质量等问题导致误诊[2]；
血清结核感染T 细胞斑点试验（TSPOT-TB）通过检测结核感染后T 淋巴细胞分泌的特异性细胞因子干扰素-γ（IFN-γ）来诊断是否存在结核感染，出结果迅速，特异性好，不受卡介苗接种和环境分支杆菌影响，有检出率快、灵敏度高等特点，在鉴别活动性与潜伏性结核感染和预测结核发病风险等方面具有重要意义[3]。对于疑似菌阴肺结核患者可考虑联合使用这两种方法，以提高结核病诊断的准确率。本研究通过分析肺泡灌洗液XpertMTB/RIF 联合血清TSPOT-TB 诊断对病原学阴性肺结核患者的应用价值，探讨诊断病原学阴性肺结核患者的可靠方法，现将研究结果报道如下。

1.1 一般资料 选取2021 年2 月至2022 年2 月在浙江省永康市第一人民医院感染科收治的120 例可疑痰病原学阴性的肺结核患者为研究对象，所有患者的3 次痰抗酸杆菌涂片检测均为阴性，且同时进行肺部CT、支气管镜检查等临床诊断，最终将120例肺结核患者分为肺结核组和非结核组，本研究由医院伦理委员会批准通过（伦理号：ykyy2020-05），所有患者均签署知情同意书。

1.2 纳入及排除标准 （1）参照《肺结核诊断标准（WS288-2017）》[4]中有关痰病原学阴性肺结核的诊断标准；
（2）意识清醒者；
（3）肝肾功能无明显异常者。排除标准：（1）合并严重并发症者；
（2）精神障碍者；
（3）伴有恶性肿瘤者；
（4）肺外结核患者。

1.3 检测方法 （1）血清TSPOT-TB 检测：采集患者静脉血5～8 mL，置于采血管，摇晃采血管，常温保存，于2 h 内分离出外周血单个核细胞，使用TSPOT-TB 试剂盒（上海复兴医药公司）。阳性结果判断标准[5]：空白对照孔斑点数为0～5 个且抗原A 或抗原B 斑点数-空白对照孔斑点数≥6；
空白对照孔斑点数6～10 个且抗原A 或抗原B 斑点数≥2 倍空白对照孔斑点数。

（2）Xpert MTB/RIF 检测：采用Olympus BFP260F 型纤维支气管镜进行检查。检查前，使用利多卡因气管内黏膜表面麻醉。协助患者取仰卧位，支气管镜由鼻腔入，对病变情况进行仔细检查后，采取导管由病灶部位注入一定量0.9%NaCl 溶液，留取肺泡灌洗液，向所采集的肺泡灌洗液中加入等体积消化液，将其放置涡旋振荡器震荡20 s 左右，摇晃至没有可见块状的痰标本为止。打开Cartridge 反应盒，用无菌吸管取出2 mL 处理后的痰样本经过加样孔慢慢加入Cartridge 反应盒里，并将Cartridge 反应盒放置GeneXpert 系统（美国Cepheid 公司），约2 h 后仪器将自动产生结果。

（3）MGIT960 药敏试验：将2 mL 痰标本转移至离心管中，加入等体积4%NaCl 溶液消化15 min；
取消化液离心10 min，加入pH 值为6.8 的无菌磷酸盐缓冲液（PBS）5 mL，4 ℃，离心15 min，去除上清液，加入1 mL PBS 充分混匀；
在MGIT 管标签上做好标记，加入0.6 mL 的（油酸、白蛋白、右旋糖和过氧化氢酶）OADC 和PANTA 抗菌素混合试剂，再加入事先处理好的标本0.5 mL，适当混匀。将MGIT 管于BACTEC MGIT 960 全自动分枝杆菌培养仪上培养，BACTEC MGIT960 荧光强度记忆探测器每隔60 min连续测定培养管内荧光强度，从而判断管内分支杆菌生长情况。

1.4 观察指标 肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF、血清TSPOT-TB 单一检测及联合检测涂阴肺结核的结果。

1.5 统计学方法 应用SPSS 20.0 软件进行统计分析。计量资料均服从正态分布，采用均数±标准差（）表示，两组间比较采用独立样本t 检验，计数资料采用χ2检验进行比较，采用受试者工作特征（ROC）曲线下面积（AUC）评估血清TSPOT-TB、Xpert MTB/RIF 及联合检测对菌阴肺结核诊断的特异度和敏感度，以P<0.05 认为差异有统计学意义。

2.1 两组病原学阴性肺结核患者一般资料比较 两组患者一般资料比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性，见表1。

表1 两组病原学阴性肺结核患者一般资料比较（例，）

表1 两组病原学阴性肺结核患者一般资料比较（例，）

注：肺结核组为经过肺部CT、支气管镜检查等临床诊断确诊的肺结核患者；
非结核组为经过肺部CT、支气管镜检查等临床诊断的非结核患者

2.2 血清TSPOT-TB 诊断肺结核的结果分析 经血清TSPOT-TB 检测涂阴肺结核阳性预测值为75.00%（48/64），阴性预测值为73.21%（41/56）。经肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF 检测涂阴肺结核阳性预测值为75.34%（55/73），阴性预测值为82.97%（39/47）。见表2。

表2 血清TSPOT-TB 肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF 诊断肺结核的结果分析（例）

2.3 肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF 联合血清TSPOTTB 在菌阴肺结核中的ROC 曲线分析 血清TSPOT-TB、肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF 及二者联合诊断涂阴肺结核的AUC 值分别为0.741、0.779、0.865，见表3。

表3 肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF 联合血清TSPOT-TB在菌阴肺结核的ROC 曲线分析

图1 肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF 联合血清TSPOT-TB 在菌阴肺结核中的ROC 曲线

2.4 Xpert MTB/RIF 诊断利福平耐药的结果分析以MGIT 960 药敏试验结果为金标准，Xpert MTB/RIF诊断利福平耐药性的阳性预测值和阴性预测值分别为88.89%（8/9）和96.86%（62/64），见表4。

表4 Xpert MTB/RIF 诊断利福平耐药的结果分析（例）

肺结核是一种常见的呼吸道传染疾病，发病原因主要与环境因素、机体自身免疫力、遗传因素等有关，容易复发，发病率逐年上升，其致死率在全国所有传染性疾病中处于第一位。目前，我国结核病现状主要为肺结核患病人数繁多、耐药性肺结核发生的概率增多、肺结核病发现率低、误诊率高等[5]。为有效治愈患者和控制肺结核传播，需提高肺结核发现率，减少误诊率。

本研究显示，经血清TSPOT-TB 检测涂阴肺结核阳性预测值为75.00%（48/64）和阴性预测值为73.21%（41/56）。说明血清TSPOT-TB 诊断涂阴肺结核患者有较高的灵敏度，这与血清TSPOT-TB 检测能在记忆T 细胞分泌的细胞因子稀释扩散前，就迅速捕捉到细胞因子有关[6]。经支气管肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF 检测涂阴肺结核阳性预测值为75.34%（55/73）和阴性预测值为82.97%（39/47）。说明肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF 诊断涂阴肺结核患者的灵敏性较高，这是由于肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF 是自动化操作，可以减少人工所带来的偏差；
肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF 还能检测出结核分枝杆菌复合群，能有效鉴定感染结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌[7]，使检测结果更加准确。

利福平是利福霉素类的半合成抗菌药，常与其他抗结核药物共同使用，用于结核病治疗，在临床上，若患者使用利福平不当，会出现耐药情况，严重影响患者的临床疗效，容易出现“多耐药肺结核”[8]。肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF 还可根据实时荧光PCR原理，检测结核分枝杆菌复合群特有的利福平耐药基因（rpoB 基因），分析利福平耐药性情况。本研究显示，以MGIT 960 药敏试验结果为金标准，肺泡Xpert MTB/RIF 诊断利福平耐药性的阳性预测值和阴性预测值分别为88.89%（8/9）和96.86%（62/64），说明肺泡Xpert MTB/RIF 诊断利福平耐药性较为可靠，为临床治疗提供了合理方案。但在细菌量级别为“极低”时，肺泡Xpert MTB/RIF 诊断无法判断利福平耐药情况，临床上需要考虑其他诊断方法[9]。

本研究显示，血清TSPOT-TB、肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF 及二者联合诊断涂阴肺结核的AUC 值分别为0.741、0.779、0.865。说明血清TSPOT-TB 和肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF 联合诊断涂阴肺结核的准确性比单独使用血清TSPOT-TB 或支气管肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF 诊断涂阴肺结核更高。这是因为血清TSPOT-TB 是通过测定外周血单个核细胞中能够释放IFN-γ 的效应T 细胞数量来判断患者是否感染结核杆菌，其阳性结果只能说明患者体内存在对结核杆菌特异的效应T 细胞，但临床上，堪萨斯、苏氏、海分枝杆菌等少数非结核杆菌也能引发肺结核，因此会遗漏非结核杆菌引起感染的结核病诊断，影响诊断结果的准确性；
临床上，肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF 可检测的标本类型多样，最常见为痰标本，患者往往会由于标本留取不规范而导致假阴性；
所以，临床上最好将血清TSPOT-TB 和肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF 二者联合诊断病原学阴性肺结核，使得两种检测方法优势互补，提高涂阴肺结核检测准确率。

综上所述，泡灌洗液Xpert MTB/RIF 联合血清TSPOT-TB 在病原学阴性肺结核诊断方面有较好的应用价值，且肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF 检测利福平耐药性较可靠，值得临床推广。