胃腺癌组织中RFC2的表达及其临床意义

李东昌，陈 可，汪正广

胃癌是临床常见的恶性肿瘤，统计数据显示：2020年胃癌的发病率和病死率均位居前五位，严重威胁人类的生命健康[1]。我国、日本、韩国等东亚国家是胃癌的高发国家[2]，胃腺癌是胃癌的最常见类型，占胃癌人群的90%[3]。尽管目前胃癌治疗方法已取得较大进展，但进展期胃癌患者的预后仍较差，患者5年总生存率仍不足30%[4-5]。因此，选择合适的分子靶点是当前研究的重点。复制因子C(replication factor C, RFC)是一类结构特异性蛋白复合物，由5个亚基(RFC1～5)组成，可以作为DNA聚合酶的引物识别因子，调控DNA的复制和修复[6]。RFC2是唯一能够使增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)脱离并抑制DNA聚合酶活性的RFC亚基，多种恶性肿瘤的发生、发展与RFC2的关系密切，其在胃癌中的研究尚未见报道。本文采用免疫组化法和Western blot法检测胃腺癌组织中RFC2的表达，探讨其与胃腺癌临床病理特征的关系及其临床意义，为临床治疗提供参考。

1.1 临床资料收集2016年1月1日～12月31日我院普外科80例行胃癌根治术的胃癌标本，术后病理结果均证实为胃腺癌。其中男性58例，女性22例；
年龄39 ～77岁，平均(57.12 ± 19.77) 岁。纳入标准：(1)术前病理结果证实为原发性胃腺癌且有手术指征；
(2)术前未行放疗、化疗或介入等其他治疗；
(3)术前无远处转移；
(4)无多发病灶。排除标准：(1)其他部位恶性肿瘤转移至胃部；
(2)因肿瘤破裂出血、穿孔、梗阻等各种原因行急诊手术者；
(3)既往曾因胃良性或恶性肿瘤行手术治疗者；
(4)合并严重的心、肺、肾等其他脏器疾病者；
(5)术后入院期间患者死亡。收集患者临床病理资料包括患者年龄、性别、肿瘤最大径、浸润深度、淋巴结转移、分化程度、肿瘤TNM分期和总生存期等临床病理指标。其中TNM分期依据AJCC分期手册(第8版)标准进行，总生存期是指患者从术后开始至死亡或失访时间。所有患者通过电话或门诊随访，截至日期2022年5月30日。本实验经我院伦理委员会审核，患者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1免疫组化 标本均经10%中性福尔马林固定，切片常规脱蜡水化，梯度乙醇脱水。免疫组化采用SP两步法，一抗兔抗人RFC2(DF4735)多克隆抗体购自Affinity公司。柠檬酸钠抗原修复，3%H2O2室温孵育25 min，一抗室温孵育1 h(RFC2，1 ∶400)。加入辣根过氧化物酶标记兔抗人IgG室温孵育45 min，磷酸缓冲盐溶液(PBS)漂洗3次，DAB显色，苏木精复染，脱水透明，封固。

1.2.2Western blot法 将组织清洗后充分研碎，加入适量RIPA细胞裂解液和PMSF蛋白酶抑制剂，提取总蛋白的操作步骤严格按试剂盒说明书进行。采用BCA法蛋白定量，高温使蛋白变性。10%SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，将蛋白转至聚乙烯二氟膜上，经5%BSA于室温封闭膜1 h，将膜置于一抗稀释溶液中4 ℃孵育过夜。TBST洗膜10 min×3次后置于辣根酶标记山羊抗兔二抗(1 ∶1 000)稀释液中室温孵育1 h，再次用TBST洗膜10 min×3次。最后用ECL化学发光法显影后，采用凝胶分析软件(Bandscan)分析所得条带灰度值，用目的条带与β-actin蛋白比值计算RFC2蛋白在组织中的表达。

1.3 结果判断采用半定量评分法对样本进行评分，RFC2为细胞核或细胞质内呈棕黄色颗粒为阳性，需根据阳性细胞染色强度与阳性细胞百分比进行判断。(1)根据阳性细胞染色强度计分：无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；
(2)根据阳性细胞百分比计分：阳性细胞数<5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。阳性细胞染色强度与阳性细胞百分比的乘积为染色指数，染色指数>2.43为高表达组，≤2.43为低表达组[7]。

2.1 胃腺癌、癌旁和正常胃黏膜组织中RFC2的表达免疫组化染色结果显示：RFC2主要在细胞质中表达，伴或不伴细胞核弱表达。RFC2在胃癌组织中的高表达率为70%(56例)，癌旁组织为47.5%(38例)，正常胃黏膜组织中无高表达，差异有统计学意义(P<0.05，图1)。Western blot检测结果显示：胃癌组织中RCF2蛋白的表达量明显高于癌旁和正常胃黏膜组织，差异有统计学意义(P<0.05，图2)。

ABC图1 A.RFC2在胃癌组织中高表达;B.RFC2在癌旁组织中高表达;C.RFC2在正常胃黏膜组织中不表达;SP两步法

2.2 胃癌组织中RFC2表达与临床病理特征的关系统计分析结果显示：胃癌组织中RFC2表达与肿瘤分化程度、TNM分期、淋巴结转移个数有关，低分化癌、Ⅲ期和淋巴结转移个数>3个者的RFC2表达明显高于高、中分化癌(χ2=23.597，P<0.001，表1)、Ⅰ+Ⅱ期(χ2=9.545，P=0.002)和淋巴结转移个数≤3个者(χ2=2.014，P=0.046)。胃癌组织中RFC2表达与患者性别、年龄、肿瘤最大径和CEA水平无关(P均>0.05，表1)。

图2 Western blot法检测RFC2蛋白表达水平：A.电泳图；
B.直方图；
*P<0.05；
***P<0.001

表1 RFC2表达与胃癌临床病理特征的关系

2.3 RFC2表达与胃癌患者预后的关系RFC2高表达组胃腺癌患者总生存率明显低于RFC2低表达组，差异有统计学意义(39.46%vs79.13%，P=0.001 7) 。其中，RFC2高表达组中位总生存期为31个月，RFC2低表达组为69个月(图3)。Cox单因素分析显示：RFC2表达、淋巴结转移、TNM分期、分化程度与胃癌患者预后有关(P均<0.05，表2)。Cox多因素分析显示：TNM分期、肿瘤分化程度和RFC2 高表达是影响胃癌患者预后的独立危险因素(P均<0.05，表2)。

图3 RFC2表达与胃腺癌患者预后的关系

2020年全球国际癌症研究机构(IARC)数据显示，我国胃癌患者约占全球的41%，其发病率和病死率均较高，严重威胁着患者的生命健康[8]。胃癌的标志物特异性和灵敏性均较差，寻找能够预测早期胃癌发生、发展、侵袭和转移的生物学标志物，对监测胃癌病程的进展、判断预后具有重要的指导价值。

RFC是一种结构特异性的DNA结合蛋白复合物，是DNA聚合酶的引物识别因子[6]。RFC在DNA复制和修复、细胞生长、细胞周期检查点以及细胞增殖的调节中起关键作用。RFC2位于人类染色体7q11.23内，编码RFC复合物中相对分子质量为4.0×104的亚基[9]。RFC2是唯一能独立脱离PCNA并抑制DNA聚合酶活性的RFC亚基[7]。DNA准确复制与癌症的发展密切相关，DNA准确复制可保证细胞的正常增殖和生长。DNA损伤修复和DNA损伤检查点功能的丧失，导致癌细胞的增殖失控。RFC2参与DNA损伤修复和DNA损伤检查点的控制，已被证明是恶性肿瘤进展的重要调节因子[10-11]。RFC2参与多种肿瘤细胞的增殖，如RFC2参与妊娠滋养细胞疾病的发生，RFC2在绒毛膜癌组织中的表达高于正常绒毛组织，RFC2与PCNA的表达呈正相关[11]。鼻咽癌患者的RFC2表达上调，高于正常组织[10]。然而，RFC2在胃癌组织中尚未见相关文献报道。本组胃腺癌中RFC2高表达率和RFC2蛋白表达量均明显高于癌旁组织及正常胃黏膜组织，RFC2蛋白高表达与患者性别、年龄、肿瘤最大径、CEA水平均无关，而与肿瘤分化程度、TNM分期和淋巴结转移数密切相关，肿瘤分化程度低、TNM分期高和淋巴结转移个数多者，RFC2蛋白表达明显升高，提示RFC2高表达可促进胃癌细胞的侵袭、转移，是胃癌侵袭性生物学行为的标志物。Cox多因素分析显示，RFC2高表达是影响胃癌患者预后的独立危险因素。Kaplan-Meier生存分析结果提示，RFC2高表达胃腺癌患者的生存期低于 RFC2低表达患者。一项关于肝癌的研究中结果显示，RFC2转录和蛋白水平高表达，RFC2高表达的肝癌患者总生存期和无瘤生存期均显著缩短，RFC2在肝癌中通过参与 DNA复制来调控细胞周期，而细胞生物学实验表明，敲除RFC2可降低肝癌细胞的增殖和迁移[12]。同时，有研究表明RFC2在尤因肉瘤中高表达，其总生存期缩短[13]。这与本组生存分析结果类似，提示RFC2高表达可能预示恶性肿瘤患者预后不良。

总之，胃腺癌组织中RFC2蛋白表达上调，是影响患者预后的重要因素，提示RFC2可能是胃腺癌患者预后的新指标和治疗新靶点。由于本实验收集的病例数较少且未涉及其分子机制的研究，尚有待积累更多病例进一步分析。