独占春×美花兰杂交F1代基于SSR标记的杂种鉴定和遗传多样性分析

韩豫　陈 彧 　饶丹丹　陈显臻　陈国德

关键词：独占春；
美花兰；
杂交F1 代；
SSR；
杂种鉴定；
遗传多样性

中图分类号：S682.31 文献标识码：A

海南野生兰花种类丰富，拥有兰科植物96 属302 种[1]， 其中独占春（ Cymbidium eburneumLindl.）、美花兰（Cymbidium insigne Rolfe.）等是海南特有种，也是国际上育种常用的起主要遗传作用的品种。因兰花的观赏价值高，市场需求量大，海南野生兰花资源被肆意采挖，野生兰生境遭到严重破坏，物种多样性降低[2]，部分兰花种源已属濒危稀缺状态[3]，美花兰已被列为国家重点一级保护野生植物，独占春被列为国家重点二级保护野生植物、濒危（IUCN 标准）。目前，海南从事野生兰花研究工作主要集中在资源调查[4-6]、品种收集、遗传多样性分析[7-8]、杂交育种及组培繁育[9]等方面，而针对野生兰保护性开发应用的研究却很少。此外，美花兰对生长环境要求较高，不易人工栽培，对其开发应用效率较低。通过独占春和美花兰杂交育种，已获得了一批适应性强又具有较高观赏价值的杂交群体。对杂交后代进行杂种真实性鉴定，可降低育种成本，缩短育种时间，同时也为海南野生兰种质资源保存、种质创新、野生兰资源推广应用提供理论和技术支持。

目前，兰花育种研究普遍采用种间及种内杂交，导致种源繁多、遗传背景复杂，易造成“同物异名”和“同名异物”的现象，这就需要对杂交后代进行鉴定分类。目前杂种鉴定方法主要有形态特征鉴定、细胞遗传学、分子细胞遗传学和分子标记等[10]。形态特征鉴定方法虽然简单直接，但是杂交后代性状相近时鉴定难度加大，且受环境和人为观测的影响。细胞遗传学鉴定方法是通过双亲和杂交后代染色体数目、形态和分裂时配对情况进行鉴定[11-12]，但此鉴定方法仅适用于染色体倍数相同的后代。分子细胞遗传学的FISH（fluorescence in situ hybridization）技术和GISH（genomic in situ hybridization）技术在远缘杂种鉴定方面应用广泛，其鉴定准确、直观，但在亲本较近的亲缘关系却难以进行鉴定[12]。随着分子生物技术的迅速发展，具有较高的准确性和有效性的分子标记技术，包括ISSR、SRAP、SSR、RAPD 等技术已广泛应用于兰科植物、农作物等遗传多态性[13]、品种鉴定[14]、遗传指纹图谱等研究方面。李玉萍等[15]采用SRAP 分子标记技术对春兰紫萼×大花蕙兰日本绿的10 个F1 代进行杂种真实性鉴定，结果表明10 个F1 代均为真实杂种，且与母本相似性较高。阮稀[16]采用ISSR 分子标记法对春剑皇梅和春兰环球荷鼎杂交的8 个F1 代进行鉴定，证实8 个F1 代为真杂种，并继承了父本的基因条带。林榕燕等[17]对文心兰杂交后代进行了EST-SSR 分子标记鉴定，结果表明46 个杂交后代株系均为真杂种，同时分析发现杂交后代与母本遗传相似系数大于父本。分子标记法的可靠性、准确性，证明了分子标记法用于海南野生兰杂交后代的鉴定的可行性。

本研究采用SSR 分子标记鉴定独占春和美花兰杂交F1 代23 个单株，分析杂交后代与亲本的亲缘关系，研究杂交后代的遗传多样性，为观赏性高的兰花品种选育提供可能，也为种质资源可持续开发、濒危野生资源保护奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

杂交试验在海南省林业科学研究院云龙科研基地兰花圃完成，以独占春（Cymbidium eburneumLindl.）为母本，美花兰（Cymbidium insigne Rolfe.）为父本进行杂交，获得杂交F1 代23 个单株，每个单株随机采集2～3 片无病虫害的新鲜叶片，用无水乙醇擦拭干净叶片表面，晾干后贮藏于有硅胶的自封袋中带回试验室。

1.2 方法

1.2.1 样品DNA 提取 使用基因组DNA 提取试剂盒（武汉纳磁生物科技有限公司）按说明书提取样品叶片DNA，采用微量分光光度计（ThermoFisher Nano Drop ONE）和琼脂糖凝胶电泳检测所提取DNA 的浓度和纯度，并将待检测样品DNA保存于–20 ℃备用。

1.2.2 SSR 引物筛选 根据陈起馨[18]在构建兰花图谱研究中的引物信息，选择48 对引物组合，在1%浓度琼脂糖凝胶上120 V 电压电泳20 min，筛选出多态性好、重复性高的引物组合8 对，用于遗传多样性分析。

1.2.3 SSR-PCR 扩增反应 在Veriti 384 well 型PCR 仪上进行SSR-PCR 扩增，扩增体系总体积为10 μL，其中，2×Taq PCR Master Mix 5 μL，10 pmol/μL F-primer、R-primer 各0.5 μL，模板DNA（20 ng）1 μL，ddH₂O₃μL。扩增反应程序：95 ℃预变性5 min；
95 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，10 个循环；
95 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25 个循环；
72 ℃末端延伸20 min，4 ℃保存。最后，取2 μL PCR产物在1%浓度琼脂糖凝胶上进行电泳检测。

1.3 数据处理

利用GeneMarker 3.0 分析软件对每对引物扩增的多个等位基因位点进行统一标记，样品中有条带记为“1”，无条带记为“0”，构建SSR 标记的0、1 矩阵。采取UPGMA 聚类方法，利用NTSYS-pc 2.10 计算遗传距离，并进行聚类分析。利用GenAIex 6.502 软件获得遗传多样性信息。

2 结果与分析

2.1 杂交后代的性质鉴定

参考陈起馨[18]兰花图谱中应用的引物，从48对SSR 引物中筛选出8 对引物（表1），利用这8对引物对独占春和美花兰杂交F1 代的23 個单株进行杂种真实性鉴定（表2）。引物Cym45、Hub131和Hub8 检测到23 个单株均兼具双亲特异位点，引物Cym25 和Hub125 检测到23 个单株仅具父本特异位点，引物Cym172 检测到12 个单株兼具双亲特异位点，11 个单株仅具父本特异位点，鉴定率达100%；
引物Cym9 检测到6 个单株兼具双亲特异位点，16 个单株仅具父本特异位点，1 个单株出现新位点，鉴定率为95.65%。综合以上7个引物的鉴定结果，受测的23 个单株均为真杂种，真杂种率为100%。

2.2 SSR 扩增遗传多样性分析

由表3 可知，利用筛选出的8 对引物对23个F1 代单株进行SSR 产物扩增（部分样品在引物Cym172 的扩增结果见图1），共检测出14 条多态性条带，平均每个引物3.11 条；
检测到25 个等位基因（Na），其中引物Cym172 扩增出的等位基因数最多，扩增出4 个；
引物Hub8 扩增出的等位基因数最少，扩增出2 个；
平均Na 为3.13 个；
有效等位基因数（Ne）变化范围为1.08～2.85，平均为1.76 个；
观测杂合度（Ho）变化范围为0.04～0.96，平均值为0.54；
期望杂合度（He）变化范围为0.08～0.65，平均值为0.36；
Shannon 信息指数（I）变化差异较大，变化范围为0.20～1.18，其中最大的引物为Cym172 ， 最小的引物为Hub125，平均值为0.62；
遗传多样性（Hs）平均值为0.68，多态性信息含量（PIC）变化范围为0.08～0.59，平均值为0.31，其中只有引物Cym172呈高度多态性（PIC>0.5），引物Cym45、Hub131、Hub8 和Cym9 呈中高度多态性（0.25

2.3 亲本与其F1 代聚类分析

对亲本和杂交F₁代计算的遗传距离分析可知，遗传距离最小的是X₁₈等14 个F₁ 单株，仅为0.0769，说明在杂交F₁ 代中样品X₁₈等14 个单株遗传差异较小；
遗传距离最大的是亲本（分别标记为D 和M），为0.9583，说明亲本的遗传表现较大。当遗传距离为0.1177 时，将亲本和23 个杂交F₁代单株分为3 个类群（图2）。第1、2 类均是亲本；
第3 类是23 个杂交F₁代单株，即杂交群体。第3 类又可分为3 个分支，X₇为一个分支，X₆和X₂₁聚类在一起，其余20 个F₁代单株聚类为一簇。

3 讨论

杂交育种是观赏性植物新品种培育的重要途径[20]，而杂交后代数量较多，对杂交后代进行杂种鉴定，从中筛选出所需要的真杂种，从而提高育种效率、缩短育种周期，对兰花新品种培育具有重要意义。常用的RAPD、SSR、ISSR、AFLP等分子标记已在多种植物杂种鉴定中得到广泛应用[21]。分子标记是在DNA 水平上直接反映的，具有较高的可靠性和稳定性，不受環境影响，且能在苗期进行早期鉴定[22-25]。SSR 标记具有高多态性、共显性遗传、易操作等优点[21]，可更准确地反映杂种与亲本遗传信息的差异。本研究的SSR 分析结果显示，独占春和美花兰杂交后代中既有兼具双亲特异位点，也有仅具有父本和母本一方的特异位点，同时也产生了新的特异位点，说明本研究的杂交后代既有遗传又有变异。通过SSR 分子标记法，在独占春和美花兰杂交后代中表现出较高的多态性，表明SSR 分子标记法可应用在海南野生兰遗传多样性分析，可建立适合海南野生兰科植物的SSR 分子标记反应体系。

兰科植物中，基于分子标记研究最多的主要是国兰、蝴蝶兰等[18， 26]。而海南野生兰因其资源的稀缺性和人工培育技术难等原因，利用分子标记方法研究海南野生兰的报道却很少。本研究采用SSR 分子标记对独占春和美花兰F1代真实性进行鉴定，这是对海南野生兰杂交后代的首次鉴定分析，对资源稀缺的海南野生兰种质的应用奠定基础。本研究从48 对引物中筛选出的8 对引物能较好的区分F1 代的真实性，而引物Cym45、Hub131、Hub8、Cym25、Hub125 和引物Cym9鉴定效率分别为100%和95.65%，说明23 个杂交后代单株均为真杂种。

分子标记法也应用于兰科植物的遗传关系、遗传多样性分析等多个方面中。王宏利等[27]采用ISSR 方法对39 份建兰品种进行遗传多样性分析，将其分为6 个群集。袁媛等[28]采用SRAP 方法对154 份国兰种质资源的亲缘关系进行分析，分析其遗传相似系数在0.772～1.000 之间。王晓英等[29]对兰属9 个品种进行AFLP 分析，遗传相似系数为0.416～ 0.606，发现莲瓣兰品种与春兰品种亲缘关系较近，而春剑品种与春兰品种亲缘关系较远。杨光穗[8]利用SRAP 分子标记研究了8 种海南野生兰属植物，将其划分为4 类。颜平[30]对168 份海南钻喙兰进行SRAP 分析，其遗传相似系数为0.486～0.959。本研究仅对杂交后代的真实性进行鉴定分析，而亲本间的遗传多样性和遗传关系有待于进一步研究。