皇帝蕉组织培养快速繁殖技术研究

樊宪伟,李志芳,韩向峰,王广琪

(1 广西大学生命科学与技术学院,南宁,530004;2 广东佛山市农业科学研究所,广东佛山,528145)

皇帝蕉MusaparadisiacaAA是我国南方种植重要草本果树,又被称为贡蕉、甜蕉、帝王蕉等,其果实较小巧,皮较薄,含糖量高,营养丰富,且有特殊的芳香味,广受大众喜爱,较普通香蕉具有更高的商品价值[1-3]。由于皇帝蕉多以芽进行无性繁殖,生产中易受尖孢镰刀菌等真菌为害,致使皇帝蕉的产量和品质下降[5]。因此,建立皇帝蕉快速组织培养体系是脱毒、预防真菌病害的有效途径。

国内皇帝蕉栽培技术方面研究较多[2,5-6],组织培养方面相对较少。朱靖杰等[7]首次利用试管苗茎段薄片诱导出胚性愈伤组织,进一步分化为芽,获得再生植株。王丽萍等[8]利用吸芽为外植体,通过消毒处理和植物生长调节剂组合建立了皇帝蕉快速繁殖体系。本研究利用皇帝蕉球茎,优化培养消毒处理和植物生长调节剂组合,建立了皇帝蕉组织培养简化体系,为皇帝蕉生产提供参考。

1.1 材料

2011年5月采自佛山市农业科学研究所大田引种的皇帝蕉种苗供试,选健壮、无病虫害的地下球茎作为外植体。

1.2 方法

外植体消毒方法筛选:采取健壮外植体,去除泥土、根等杂物洗净后剥去外层叶鞘,用洗洁精擦洗,再用自来水流水冲洗30 min,将材料放置在超净工作台上。设置不同消毒方式处理,即75%酒精30 s+0.1%升汞15 min;75%酒精30 s+0.1%升汞10 min;75%酒精30 s+0.1%升汞10 min消毒两次(第一次消毒后的酒精和汞回收再次使用)等3个处理。消毒后球茎切成1 cm3块,迅速放入初代培养基,即MS+细胞分裂素6-苄氨基嘌呤1.5 mg/L+吲哚乙酸0.1 mg/L中培养,每个外植体单独放1瓶,每处理复3次,每个重复10瓶,10 d后调查3种不同消毒处理的污染情况及发芽状态,污染率(%)=污染数/接种数×100。

继代、生根培养基:MS培养基每升添加蔗糖30 g、琼脂5.5 g,pH值5.8～6.0。

增殖培养基:以MS培养基为基础培养基,添加不同浓度6-苄氨基嘌呤、吲哚乙酸等植物生长调节剂诱导吸芽萌发、增殖,即MS+6-苄氨基嘌呤1.0 mg/L+吲哚乙酸0.1 mg/L、MS+6-苄氨基嘌呤2.0 mg/L+吲哚乙酸0.1 mg/L和MS+6-苄氨基嘌呤2.5 mg/L+吲哚乙酸0.1 mg/L等3个处理,筛选适宜的增殖培养基。

生根培养基:以MS培养基为基础培养基,设置1/2MS+吲哚乙酸0.4 mg/L和1/2MS+吲哚乙酸0.2 mg/L两个处理。

继代试验每瓶接种芽苗10株,重复3次,每个重复接种5瓶,30 d后调查平均分化系数及芽体生长情况,平均分化系数(%)=分化不定芽株数/接种株数×100;生根试验每瓶接种芽苗12株,重复3次,每个重复接种6瓶,20 d后调查生根率、有效生根率及根系生长情况,生根率(%)=生根株数/接种株数×100,有效生根率(%)=具有2条以上粗壮根株数/接种株数×100。

除初培和生根试验需要暗培养,其余试验培养光照均为1 500～2 000 Lx,温度(23±2) ℃,每2～3 d观察1次,并做好记录。通过初培、继代、生根培养试验,筛选快速繁殖的最佳培养处理。

炼苗试验方法:先进行3 d闭瓶炼苗,再经过3 d开瓶炼苗,然后将生根幼苗从培养瓶慢慢取出,用流水轻轻冲洗掉根系上的培养基,并用0.1%多菌灵杀菌液清洗;最后将幼苗分别种植在消毒后不同基质营养盘中,即设置泥炭土、塘泥+椰糠、椰糠等3种不同基质,重复3次,每个重复生根苗约40株,20 d后统计炼苗成活率,成活率(%)=成活株数/种植株数×100。

1.3 数据分析

数据采用SPSS软件进行多重比较或T-test,在p<0.05时差异显著。

2.1 初代培养情况

皇帝蕉外植体在初代培养基上均呈现不同程度褐变,接种时间越短,褐变越轻;培养1周后外植体开始膨大,由最初的乳白色逐渐转绿;生长点部位开始凸起,10 d左右开始露出芽点;15～20 d后,中心生长点周围开始出现许多淡黄或浅绿色的不定芽,然后逐渐转为黄绿,渐渐长出许多叶片变成完整芽体(见图1)。

图1 皇帝蕉组培及田间种植生长情况

2.2 不同消毒处理的影响

消毒处理的外植体培养3 d,部分材料发生少量细菌污染,5 d部分材料出现霉菌污染,10 d调查污染率发现,75%酒精30 s+0.1%升汞15 min处理的污染率较低,为33.3%,污染少,褐变重,出芽少,少量死亡,诱导出芽少;75%酒精30 s+0.1% 升汞10 min处理的污染率为43.3%,褐变较轻,菌少,出芽较多;消毒两次处理的污染率最高,为50.0%,褐变轻,细菌污染较多,与75%酒精30 s+0.1%升汞15 min处理的污染率差异显著(见表1)。结合污染及生长情况认为,75%酒精30 s+0.1%升汞10 min消毒处理对初代培养效果较好。

表1 不同消毒处理对初代培养及不同增殖培养基对不定芽增殖的影响

2.3 不同增殖培养基的影响

不同增殖培养基处理的不定芽增殖存在显著性差异,MS+6-苄氨基嘌呤2.5 mg/L+吲哚乙酸0.1 mg/L处理的不定芽增殖效果最好。3个增殖培养基中,随着6-苄氨基嘌呤处理浓度升高,继代苗的生根量减少,只有个别大芽有生根现象(见表1和图1)。

2.4 不同浓度吲哚乙酸对生根的影响

皇帝蕉易生根,在生根培养基上培养5 d时产生少量根,培养10 d后大部分组培苗生根,根长1 cm左右,且无愈伤组织产生(见图1)。1/2MS +吲哚乙酸0.4 mg/L处理的生根率为94.0%,有效生根率(单株生根数>2条)为86.0%,单株多为4条根,根粗壮,生根效果较好;1/2MS+吲哚乙酸0.2 mg/L处理的生根率为89.5%,有效生根率为80.0%,单株生根2～3条,单根较多,根细,生根效果一般,2个处理之间无显著性差异(见表2)。2个处理随着吲哚乙酸浓度增加,单株生根量增加,根也较粗壮,有效生根率也提高。

表2 不同浓度吲哚乙酸对皇帝蕉组培苗生根及基质对移栽的影响

2.5 不同基质的影响

3个基质处理的移栽成活率无显著性差异,移栽成活率均大于97%(见表2)。皇帝蕉生长对土质要求不严格,在泥炭土、椰糠、塘泥+椰糠的基质上均能良好生长。因此,只要温湿度和光照合适,皇帝蕉组培苗生长势都较强,供试基质对炼苗成活率无显著性影响,均能达到较好的炼苗效果(见图1);组培苗营养情况差异也较小,只要后期肥水管理到位,对成品苗的生长并无影响。

2.6 组培苗田间生长情况

田间观察发现,皇帝蕉组培苗生长整齐度高,染病少,组培皇帝蕉果指中大,口感甜,产量高,品质好(见图1)。巴西蕉是当地香蕉主栽品种,产量是皇帝蕉的2倍多;但巴西蕉田间批发价格较低,最高2元/kg左右,而皇帝蕉批发价5元/kg左右,皇帝蕉的经济价值比巴西蕉高。

试验中,皇帝蕉外植体不同消毒处理后污染率偏高,可能由于当时采样期间连续降雨高温,材料采自泥水浸泡的地下块茎部分,外植体携带菌群较多,组培条件菌类繁殖速度快且多;若在干旱少雨季节取材料,污染率应该会降低,有待进一步验证。同时,研究发现随着消毒时间延长,升汞对植物的毒害杀伤作用也越强,轻者杀伤褐变,影响芽萌发,重者直接导致材料死亡。鉴于升汞对环境具有污染性,后期试验可尝试用次氯酸钠或其他消毒剂代替升汞作为外植体的消毒试剂。

香蕉组织培养中容易发生褐化。本试验研究发现,皇帝蕉在组织培养过程中较其他植物材料易褐变,且褐变严重时会影响皇帝蕉发芽,创伤面越大褐变越厉害,材料越老越容易褐变;随着继代次数增加和创伤面减小,褐变现象会减轻,说明幼嫩组织褐变轻。因此,选取外植体时应尽量靠近地上部分新生芽,较小的吸芽作为外植体可能会减少污染及减轻褐变现象。

细胞分裂素和生长素浓度配比是决定组织培养诱导丛生芽的关键因素。王丽萍等[8]研究指出,6-苄氨基嘌呤3.0 mg/L+吲哚乙酸0.1 mg/L时皇帝蕉增殖较快。本研究采用初代培养基进行吸芽诱导,发现增加细胞分裂素——6-苄氨基嘌呤的浓度,即MS+6-苄氨基嘌呤2.5 mg/L+吲哚乙酸0.1 mg/L时,皇帝蕉增殖最快,分化不定芽系数达到3.3;且不定芽无玻璃苗,芽体饱满,长势健壮。有研究发现,采用MS+3-吲哚丁酸2.5 mg/L+萘乙酸0.2 mg/L最适合皇帝蕉幼苗促根培养[8]。本研究发现,1/2MS+吲哚乙酸0.4 mg/L生根培养基效果较好,生根率达到94%,根系健壮、发达,这也是炼苗期间皇帝蕉成活率高的基础。皇帝蕉生根根系发达,炼苗期间对不同基质适应性广,成活率均在97%以上。田间观察发现,供试皇帝蕉组织培养苗生长速度快,整齐度高,无病毒病和尖孢镰刀菌枯萎病发生。