早产儿NEC与MD-2基因多态性相关性分析

邱红 毛仁萍 王晓珺 李艳红 吕勤

坏死性小肠结肠炎（Necrotizing enterocolitis，NEC）是早产儿常见并发症，可危及新生儿生命。主要症状是腹胀、呕吐和血便［1-2］。主要病理症状是回肠末端和近端结肠的炎症性出血性坏死，当病情严重时，可能会出现脓毒症、休克和多器官功能障碍综合征等并发症。NEC 的病因和发病机制尚未完全明确［3-5］。因此，识别早产儿NEC 的危险因素和发病机制，积极预防和治疗NEC，对于提高早产儿的生存率和生活质量具有重要意义。目前，研究表明基因多态性与NEC 存在相关性［6］。MD-2 是识别脂多糖受体复合物的Toll 样受体信号通路的关键成分之一［7-8］。本研究从单核苷酸多态性的角度研究基因多态性与NEC 的相关性。现报道如下。

1.1 临床资料 选择2020 年1 月至2022 年12 月本院新生儿重症监护病房收治的确诊早产儿NEC120 例（NEC组），将功能性多态点与同期非坏死性小肠炎患儿120 例（非NEC 组）进行对照分析。收集患者一般资料，主要包括性别、胎龄、标本采集日龄、出生体重、出生方式等。NEC 组纳入标准：符合NEC 的Bell 分期诊断标准，且Bell 分期＞Ⅱ期。排除标准：心脏、肝、肾、神经、呼吸道、血液严重疾病或先天消化道畸形、肠旋转不良、自发性肠穿孔、病历资料不全、入院数小时死亡等。非NEC 组纳入标准：非坏死性小肠结肠炎患儿，但属于高危患儿；
与NEC 组一般资料相匹配。排除标准同NEC 组。本研究获得医院伦理委员会批准。

1.2 方法 （1）MD-2 基因多态性检测指标：MD-2 有四个外显子。通过参考美国国家生物技术信息中心的基因序列服务数据库和寡核苷酸多态性数据库以及相关文献，将MD-2 基因的1、2 和4 外显因子和MD-2 启动子区的rsll465996 多态性区选为研究片段。通过基因测序观察NEC 早产儿中这些基因片段的多态性，并将多态性位点与非NEC 组进行比较。（2）标本采集：抽取NEC 组48 h 内和非NEC 组住院期间桡动脉血1 mL，装于环氧树脂管内进行分装，放置冰箱保存。（3）提取基因总DNA 及目的片段扩增：采用硅基质吸附柱法从血液样本中提取基因组DNA，采用2×Taq Master Mix对所提取的DNA 进行PCR 扩增，对扩增产物进行一代测序（双向测序），交由化洛生物科技（上海）有限公司进行合成。PCR 扩增引物及测序引物。见表1。（4）产物电泳：使用2%琼脂糖对PCR 产物进行电泳，并将其与标记进行比较，以确定产物的大小是否与目标片段一致。见表2。（5）产物纯化与测序：电泳后，PCR产物送至化洛生物科技（上海）有限公司按照操作流程进行纯化测序。见表3。

表1 PCR扩增引物及测序引物

表2 D-2基因外显因子和多态性的PCR扩增体系

表3 D-2基因外显因子和多态性的PCR程序

1.3 统计学方法 采用SPSS 24.0 统计软件。计量资料以（±s）表示，用t检验；
计数资料以n（%）表示，用卡方检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2.1 两组一般资料比较 见表4。

表4 两组一般资料比较

2.2 外显因子基因多态位点的测序 NEC 组中未检测出功能性多态性的位点。

2.3 启动子区域C-1625G 多态性的位点 NEC 组C/C基因型频率为54.2%，C/G 基因型频率为45.8%，非NEC组C/C 基因型频率为65.0%，C/G 基因型频率为35.0%，两组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。手术组C/C 基因型频率为50.0%，C/G 基因型频率为50.0%，与非NEC组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。NEC 组G 等位基因型频率为22.9%，非NEC 组G 等位基因型频率为11.7%，两组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；
手术组G 等位基因型频率为10.4%，与非NEC 组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。手术组G 等位基因频率与非手术组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表5。

表5 NEC组与非NEC组的基因型和等位基因的分布频率

2.4 非手术组与手术组转归比较 见表6。

表6 非手术组与手术组转归比较（n）

国内研究指出，NEC 的病因可能与早产儿、肠道喂养、缺氧缺血有关。NEC 发生败血症时体内细菌会大量繁殖生成毒素导致炎症反应与抗炎失衡，最终引发肠黏膜坏死［9］。但暴露于相同环境或干预条件，NEC 也仅发生于一部分新生儿（尤其早产儿）；
且不同新生儿病情严重程度差别较大，因此，遗传背景可能在NEC发病中起重要作用［10］。

MD-2是识别脂多糖受体复合物的Toll样受体信号通路的关键成分之一。研究指出，MD-2 的转录效率会受rsll46599 多态性位点的影响，而MD-2 外显因子1 号发生变异会降低LPS 发出信号［11］。在新生儿中，NEC发病的主要因素与TLR4 信号通路异常调控有关。而MD-2 是TLR4 信号通路的辅助因子，若发生转录和功能改变会影响TLR4信号通路的转录与活化。本研究中，NEC 组并未检测出功能性多态性的位点，表明MD-2 蛋白结构改变可能与NEC 疾病的发生无相关性。有研究指出，MD-2 错义突变会导致结构变化，降低MD-2 的受体和LPS 的结合能力，但可能与NEC 的发生无关［12］。

rsll465996 是MD-2 基因中较为常见的研究位点，若基因频率发生改变可能会影响MD-2 基因的转录功能。有研究显示，rsll465996 基因位点与败血症的发生密切相关［13］。GU 等指出，MD-2 基因位点的活性受该位点的影响［14］。本研究中，NEC 组C/C 基因型频率与和C/G 基因型的频率与非NEC 组基因频率比较差异无统计学意义（P＞0.05）；
手术组G 等位基因型频率与非NEC 组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。手术组G 等位基因频率与非手术组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。表明NEC 的严重程度与rsll465996 位点的G等位基因有关。

临床上对NEC 患儿的手术时机的选择和手术效果，一直存在较大争议。本研究中，手术组患儿为重症NEC，患儿出现腹胀、便血、低血压、经皮氧饱和度波动等，实验室检查提示感染指标升高、酸碱平衡紊乱、电解质紊乱，腹部影像学检查提示腹水、固定肠袢、 肠蠕动减少或消失等时，内科保守治疗无效或病情进展，需要考虑手术治疗。本研究显示手术组治愈率低于非手术组，预后不良发生率高于非手术组，这与NEC 手术组患儿存在肠道感染重且进展快有关。rsll465996 基因位点与感染发生密切相关，手术组该基因G 等位基因型频率高于非NEC 组和非手术组，因此rsll465996 基因G 等位基因型频率高与手术适应证及预后存在相关性。

综上，早产儿NEC 发病与MD-2 基因的外显因子基因多态性无关，但疾病的严重程度、手术适应证可能与G 等位基因有关。但本次研究由于样本量较少，并未进一步探讨炎性因子基因多态性是否与NEC 有关，因此具有有一定的局限性，今后还需纳入更多样本量来进行研究。