杜宇鑫，陈英曜，叶枫，俞超
摘要：柑桔黑斑病是一种真菌型致病菌引起的高发性病害，对柑桔产业的危害极大。本文综述总结了黑斑病病原菌的发现、检测方法，以及遗传多样性分析技术，以期为该病的预防诊断提供参考。
关键词：柑桔；黑斑病；病原菌；研究进展
柑桔是全球重要的水果品种之一，我国也是柑桔的种植地，种植柑桔品种繁多。柑桔黑斑病（Citrus Black Spot，CBS）是一种针对柑桔发作的真菌型病害，主要危害果实和叶片产生褐色或黑色病斑，CBS是柑桔产地的高发性病害。近年来，随着柑桔出口量的增长和感病品种的推广，CBS问题日益突显。但国内，有关CBS的研究报导较少，本文就黑斑病病原菌的发现、检测方法及遗传分析进行归纳分析，希望对后续该病害的防治有所帮助。
1病原菌的发现
1895年，Benson初次在澳大利亚一柑桔园中发现CBS，并发表CBS病果的图片。1948年，Kiely在澳大利亚东南部发现CBS病菌为柑桔球座菌并命名为Guignardia citdcarpa Kiely，该病菌属子囊菌门、腔菌纲、座囊菌目、座囊菌科、球座菌属。Mcalpine初次将该病害病原鉴定为柑桔茎点霉Phoma citricmpa McAlpine。1973年，Van der Aa经过翻阅资料和从新检测模式菌，将柑桔茎点霉归到叶点霉属，重新命名为柑桔叶点霉菌Phyllosticta citricarpa McAlpine VanderAa。因国外发现并研究较早，所以对国内研究带来诸多便利条件。
1919年日本学者泽田兼吉在台湾泽田兼吉发现CBS，随后Lee报导了我国南部地区CBS调研情况。Fawcett在1936年记录CBS在我国福建、云南、浙江等主要产区出现。朱伟生和曾宪铭对引起CBS的病原菌先后做了全面报导。肖育贵、吕良琼等对柠檬黑星病病原菌进行系统研究，认为诱发柠檬黑斑病的病原是球壳孢目科茎点霉属的真菌（Phoma catracarpa）。蒲占清等对浙江台州地区CBS的发生情况进行了调查研究，发现台州黄岩地区CBS染病比较普遍，其中当地早桔、慢桔和黄岩蜜柑染病较严重。
2病原菌的检测
2.1形态鉴定
柑桔果皮病斑的分生孢子和孢子器的显微形态可作为鉴定柑桔叶点霉的根据。如果病斑上有分生孢子器，可直接用显微镜检查其分生孢子器和分生孢子特征；如无分生孢子器，则可诱导带病斑的果皮形成分生孢子器。但诱导产生分生孢子器至少需要5d。鉴定柑桔叶点霉可从病灶组织中分离培养并在特定培养基上形成具有特征性的菌落和分生孢子。但是，病菌培养缓慢，生长出典型的菌落至少需要2～3d，分离过程中常常受生长较快的其余类真菌的污染。而且，果实上的内生菌P.capitalensis也会干扰依据培养性状和孢子形态的诊断。这些传统的形态鉴定方法不但需要熟练的技术人员操作，而且耗时耗力，操作相对随机。许多植物病原菌在侵染后具有相似的症状，这给识别病原菌带来困难，不够准确，需要多种方法来做同一检测”。
产生类似CBS的病斑也有其他真菌或昆虫的侵害的可能性。这些因素对依据症状诊断CBS带来困难。故开发了一些较为准确、高效的分子鉴定方法。
2.2分子检测
2.2.1基于ITS序列的PCR檢测。基于种群特异性的ITS序列PCR检测对于黑斑病已经成为当前标准的检测方法。
Bonants等分析病原菌（P.citdcarpa）和非致病病原菌（P.capitalensis）的ITS区域，分别设计出特异性引物GCF3/GCR7和GCF2/GCR4。特异性引物GCF3/GCR7可以鉴定出60%～70%没有分生孢子器的病斑，鉴定出90%具有分生孢子器的病斑。为了更快地区分这2个种，Meyer等发明了一天快速区分2个种的方法，通过分析ITS区域设计了针对于致病病原菌的特异性引物CITRIC1/ITS4 580bp，针对于非致病病原菌的特异性引物CAMEL2/ITS4 430bp，利用设计好针对不同种的特异性引物可以在短时间内快速鉴定病原菌。为提高鉴定病原菌的效率，Peres等在对比之前设计的种特异性引物发现P.citricarpa特异性引物CITRIC1/ITS4不能扩增出单个病斑提取的病原菌DNA，即检测灵敏度较低。因此在ITS区域设计了灵敏度高、特异性好的特异性引物GCN/GCMR，该引物可以扩增单个病斑提取的病原菌DNA，该灵敏度分别是引物GCF3/GCR7和CITRIC1/ITS4的10倍、100倍。
基于ITS序列的PCR检测方法无法准确无误地鉴定该菌。故出现基于RAPD的检测方法。
2.2.2 qPCR检测方法。定量聚合酶链式反应（qPCR）是当今世界用于最先进核酸分子诊断技术之一，具有操作简单、检测时间短、精度高等特点，已被广泛用于定量化检测真菌病原菌。
Brouwershaven等用PCR和qPCR检测技术对采用不同方法提取的病源菌DNA进行ITS序列的检测，结果发现qPCR的检测精确度最高，可以检测较低浓度的柑桔黑斑病病原菌DNA。为了得到致病菌和非致病菌准确且快速高效检测，van GENT-PELZER等在ITS区域设计探针，利用qPCR的方法区分P.cilri-carpa和P.Capitalensis，特异性和灵敏度都优于普通PCR方法。Stringari等在随机扩增多态性DNA标记技术（RAPD）的基础上设计出针对P.citricarpa的特异性引物。
由于基于qPCR的检测技术精度较高而被专家学者采用，但其依然存在对仪器设备要求高、需要采用荧光染料和对引物要求高等弊端。
3病原菌遗传多样性分析
3.1 RAPD分子标记技术
柑桔叶点霉会导致果皮呈现黑色病斑。因病斑与柑桔球座菌诱发的病斑类似，所以Danyelle等对收集的样本进行扩增DNA（RAPD）和序列的扩增区域特征分析（SCARS），结果表明这2种方式都能有效地区别致病菌和非致病菌在形态学上十分相似的病菌。
Possiede等用RAPD技术对已具有苯菌灵（Benomyl）抗性的柑桔球座菌进行检测，猜想可能由于菌株拥有复杂的基因从而使该菌株对苯菌灵产生抗性。此外，Chirlei和Tedford等通过RAPD分析研究柑桔球座菌发现病菌的基因相似程度与寄主不相关，Ricardo等用荧光素标记的选择性扩增片段长度多态性技术（Fluorescent Amplified Fragment Length Poly-morphism，fAFLP）对疑似CBS样本进行分析，发现CBS致病病菌和非致病病菌发源于共同的祖先，但环境等因素会引发其进化。
基于RAPD检测虽然有操作方便、不需要基因克隆、灵敏度好，能表现出丰富的多态位点等优点，但也有诸多弊端，例如模板浓度、PCR的循环次数等都会因RAPD的检测重复性差而导致失败。
3.2 AFLP分子标记技术
扩增片段长度多态性技术（AFLP）并连系限制性内切酶片段长度多态性标记技术（RFLP）和PCR技术优点，同时兼备了高效性、可靠性、可重复性和所需DNA微量性的优点。Baayen等利用限制性内切酶Mspl和EcoRI用AFLP技术对样本进行分析得出与ITS序列的结果相同并确定出柑桔球座菌。
AFLP分子标记技术虽然具有RAPD和RFLP稳定性高的优点，但也需要较高的纯度和反应条件。所以也可采取第2代ISSR标记技术。
3.3 ISSR分子标记技术
Zietkeiwitcz等建立一种在微卫星基础上的分子标记技术（ISSR）。为得到柑桔叶点霉菌种遗传多樣性分析的ISSR反应的合适体系，王兴红等针对一系列影响较大的因素对ISSR反应体系进行优化。
与之前方法相比，不需了解物种遗传背景、操作便捷、引物设计简单以及成本低廉都是ISSR分子标记技术的优势。但该技术缺点则是易受许多因素的干扰，在不适宜的条件下会导致图谱拖带、扩增条带弥散甚至消失，严重影响后期的鉴定和分析。因此在ISSR技术进行分析之前，需要找到适合的条件，以确保试验的准确性。尽管此标记方法弊端较多但也在诸多方面体现出其优于其他技术标记手段的方面，并且为今后采用ISSR分子标记技术对遗传多样性的分析打下坚实理论和技术的基础。
4展望
早期的形态学鉴定虽具有直观便捷的优势，但在准确分析判定和区分方面依然存在很大弊端，虽然分子检测技术的推广鉴定CBS上升了一个台阶，但由于各种检测技术都存在其自身的利弊，所以今后在研究和鉴定CBS时应选取适合的技术。
目前大多数柑桔产区在病害暴发时喷洒化学农药。化学农药有无法在自然界中降解毒性并损害人们身体的弊端。在未来应更深入地开展研究，尤其是在抑菌方向可筛选一些天然提取物制成更科学更绿色更健康的生物农药，并在一定程度上能够抑制CBS的生长，不但为农民的经济收益带来保障，而且为保护环境作出重要贡献，也对黑斑病的研究和防治提供更多参考和帮助。
