五加丹方对绝经综合征模型大鼠下丘脑PLC-β/IP3/CaM,通路作用的研究

赵铭宇，吕 波，李 灼，潘海云，刘桂兰

（黑龙江省中医药科学院，黑龙江 哈尔滨 150036）

绝经综合征（menopause syndrome，MPS）的发生受性激素水平及中枢神经递质变化影响。我国城市女性平均绝经年龄（48.35±3.62）岁［1］，据统计局网站数据显示，2008 年我国45～59 岁的女性占女性总人口数21%，而2020 年则升至24%，随着人口老龄化进程，以及诸如来自社会、家庭以及心理等因素影响［2］，进入围绝经期女性的比例逐年增长，女性平均有近30 年的时间在绝经后度过［3］，因此有效预防及改善绝经综合征症状，具有重大的社会意义。

目前越来越多与生殖内分泌相关的基因被发现，如Kisspeptin 基因等。Kisspeptin 基因是一类信号传导神经肽，由下丘脑Kiss-1 基因编码，该基因可调节促性腺激素释放激素分泌，与生殖功能密切相关［4］。KISS-1 基因与其受体GPR54 相结合后，刺激胞内PLC-β 信号发送，使PIP2 代谢为二酰甘油（DAG）和肌醇1，4，5-三磷酸（IP3）［5］。IP3 作为第二信使同IP3 受体（IP3R）相结合，引起内质网膜上Ca2+的释放，启动细胞内Ca2+信号系统，通过钙结合蛋白（CaM）等促进下丘脑促性腺激素释放激素（gonadotropin-releasing hormone，GnRH）的释放［6］。

五加丹方具有滋补肝肾、调节阴阳、养血安神作用，上世纪九十年代始用于临床，改善绝经综合征中多种症状表现尤其是烘热汗出等疗效显著［7］，本实验试图通过对Kiss-1 细胞内因子PLC/IP3/CaM 通路的研究，观察五加丹方对去卵巢模型大鼠GnRH 上游因子的干预作用，现报道如下。

1.1 实验动物

SD 雌性大鼠64 只，鼠龄3～4 月（由长春亿斯实验动物技术有限责任公司提供），合格证号：SCXK（吉）2018-0007。动物饲养及处理严格参照黑龙江省中医医院伦理委员会标准执行，伦理委员会批准编号：201908005。

1.2 实验药物

五加丹方组成：刺五加50 g，生龙牡各60 g，丹参、炒酸枣仁各30 g，熟地25 g，枸杞子20 g，丹皮、赤芍、当归、地骨皮各15 g（门诊中药局提供）。更年安片（国药准字Z20073293）。戊酸雌二醇片（补佳乐）（批号：J20171038）。

1.3 实验试剂及主要仪器

大鼠PLC-β 试剂盒、IP3、IP3R 试剂盒、CaM 试剂盒购于南京建成生物工程研究所。GnRH 及Calmodulin（Affinity 中国），TRIpure、Super M-MLV等由北京百泰克生物技术有限公司提供。SYBR Green 由北京索莱宝科技有限公司提供。Exicycler 96 荧光定量PCR 仪（韩国BIONEER）；
Dyy-Ⅲ型电泳仪（北京六一）。

1.4 实验方法

1.4.1 动物分组与造模 随机将64 只大鼠分为正常组（NG）10 只、模型组（MG）10 只，五加丹方高（WH）、中（WM）、低剂量组（WL）各8 只；
中药对照组（TMC）及西药对照组（WMC）各10 只。除NG组外，余各组大鼠采用腹腔麻醉，起效后仰卧位固定大鼠，逐层进入腹腔，摘除双侧卵巢组织，消毒止血缝合，查验无出血关腹。摘除卵巢并观察体征3 d后，进行阴道脱落细胞涂片每日1 次，以连续5 d 无规律动情周期出现则可判定模型复制成功［8］。

1.4.2 动物给药及取材 造模成功后，换算给药剂量，灌胃给药浓度为WH 组：20 g/kg 生药，WM 组：10 g/kg 生药，WL 组：5 g/kg 生药，TMC 组：更年安片0.56 g·kg-1·d-1，WMC 组：补 佳 乐 片0.1 mg·kg-1·d-1；
NG 组、MG 组等剂量生理盐水，给药周期28 d。第29 日同前使用10%水合氯醛腹腔麻醉，无菌条件下处死大鼠并按照《大鼠脑立体定位图谱》［9］，迅速剥离出下丘脑弓状核组织，立即用吸水纸吸净表面水分及少许血液，当即存放冻存管中，液氮保存并转至-80 ℃冰箱备用。实验初期，空白组灌胃死亡1 只。

1.4.3 ELISA 实验过程 检测时按照每1 g 与生理盐水2 mL 的比例匀浆，3 500 r/min 20 min 制备组织匀浆液，并严格遵守ELISA 试剂盒要求操作，检测各组大鼠脑组织匀浆中PLC-β1、IP3、IP3R 以及CaM 水平。

1.4.4 PCR 检测 PCR 实验流程及步骤：下丘脑组织匀浆后，利用Trizol 法提取总RNA，测定每组各样本中RNA 浓度，反转录后取20 μL cDNA 样本，-20 ℃冻存备用。反应条件：预变性94 ℃，5 min；
变性94 ℃，10 s；
退火60 ℃，20 s；
延伸72 ℃，30 秒，40 个循环。72 ℃，延伸2.5 min，40 ℃温育，1 min 30 s，从60 ℃到94 ℃开始熔解，每秒1.0 ℃，25 ℃温育1～2 min。荧光定量分析。每个样本3 个复孔。

1.4.5 western-blot 检测 裂解样本，离心分离出蛋白质抽提物，按照BSA 蛋白标准液，计算出样本蛋白浓度。制备聚丙烯酰胺凝胶，分离胶浓度为12%、15%，调整电流至最大，电压80 V，恒压电泳2.5 h。转膜电压80 V，转印1.5 h。5%（M/V）脱脂奶粉封闭后，TBST 摇床清洗。1∶（500～2 000）稀释一抗。ECL 化学发光。将PVDF 膜进行扫描，用凝胶成像处理系统分析目标条带的光密度值。

1.5 统计学处理

表1 引物序列Tab 1 Primer sequence

2.1 各组大鼠血清PLC-β1、CaM、IP3、IP3R 水平

与NG 组相比，MG 组PLC-β1、CaM、IP3R 水平均显著升高（P＜0.01）；
MG 组IP3 水平明显升高（P＜0.05）。与MG 组 相 比 较，WMC 组PLC-β1 水 平显著下降（P＜0.01）。与MG 组相比，WH、WM 组PLC-β1 水 平 明 显 下 降（P＜0.05）。与MG 组 相 比较，WH、WM 组、WMC 组CaM 水平明显下降（P＜0.05）。与MG 组相比，WM 组IP3 水平显著下降（P＜0.01）；
WH 组、WMC、TMC 组的IP3 水平明显降低（P＜0.05）。与MG 组相比，WMC 组IP3R 水平明显降低（P＜0.01），WH 组IP3R 也明显下降（P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠下丘脑匀浆PLC-β1、CaM、IP3、IP3R 水平比较（±s）Tab 2 Comparison of levels of PLC-β1，CaM，IP3 and IP3R in hypothalamus homogenate of rats in each group（±s）

表2 各组大鼠下丘脑匀浆PLC-β1、CaM、IP3、IP3R 水平比较（±s）Tab 2 Comparison of levels of PLC-β1，CaM，IP3 and IP3R in hypothalamus homogenate of rats in each group（±s）

注：与NG 组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；
与MG 组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

IP3R组别nPLC-β1CaM IP3 76.28±14.92 141.90±15.60**96.70±21.16▲105.05±3.96*136.30±22.60**113.91±23.93*89.29±18.97▲▲7.996 NG MG WH WM WL TMC WMCF9 1 0 8 8 8 1 0 10 1.18±0.64 2.57±0.81**1.51±0.64▲1.65±0.64▲2.02±0.41*1.90±0.56*1.43±0.60▲▲3.85 88.66±26.37 224.13±59.97**125.93±15.10▲149.29±47.44 185.91±41.09**149.37±16.61▲*102.47±53.79▲5.168 75.33±15.56 144.28±21.65*79.36±23.66▲78.62±16.79▲▲133.36±19.80*83.10±29.25▲70.58±15.56▲6.558

2.2 各 组 大 鼠 下 丘 脑 组 织 GnRH、PLC-β、IP3R-1mRNA 的表达

MG 组PLC-β1 mRNA、IP3R1 mRNA 的 表 达显著高于NG 组（P＜0.01）；
WH 组、WMC 组 PLC-β 1 mRNA、IP3R1 mRNA 的表达显著低于MG 组（P＜0.01），WM 组PLC-β1mRNA、IP3R1 mRNA 的表达也明显低于MG 组（P＜0.05）。TMC 组、WL 组与MG 组比较，PLC-β1 mRNA、IP3R1 mRNA 的表达无明显差异（P＞0.05）。见表3。

表3 各组大鼠下丘脑弓状核GnRH、PLC-β1、IP3R1 mRNA 表达结果比较（±s）Tab 3 Comparison of the expression of GnRH，PLC-β1 and IP3R1 mRNA in hypothalamic arcuate nucleus of rats in each group（±s）

表3 各组大鼠下丘脑弓状核GnRH、PLC-β1、IP3R1 mRNA 表达结果比较（±s）Tab 3 Comparison of the expression of GnRH，PLC-β1 and IP3R1 mRNA in hypothalamic arcuate nucleus of rats in each group（±s）

注：与NG 组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；
与MG 组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

组别NG MG WH WM WL TMCn9 1 0 8 8 8 1 0 PLC-β1 1.000±0.060 1.75±0.156**IP3R1 1.000±0.050 1.540±0.121**GnRH 1.000±0.060 2.363±0.406**WMCF10 1.09±0.030▲▲**1.44±0.101▲**1.59±0.101**1.51±0.105 **1.02±0.032▲▲1.070±0.036▲▲*1.293±0.087▲**1.430±0.171*1.205±0.011▲**1.030±0.026▲▲1.133±0.051▲▲*1.567±0.232▲*2.143±0.500*1.537±0.229▲*1.050±0.026▲▲*11.596 33.121 2.687

2.3 各组大鼠下丘脑组织CaM、GnRH 蛋白的表达

与NG 组比较，MG 组GnRH 蛋白、CaM 蛋白的表达显著升高（P＜0.01）。各给药组GnRH 蛋白、CaM 蛋白的表达均低于MG 组（P＜0.01），WL 组CaM 蛋白的表达也明显下降（P＜0.05）。见图1，2及表4。

图1 大鼠下丘脑GnRH 蛋白表达Fig 1 Expression of GnRH protein in rat hypothalamus

图2 大鼠下丘脑CaM 蛋白表达Fig 2 Expression of CaM protein in rat hypothalamus

表4 各组大鼠下丘脑弓状核GnRH、CaM 蛋白的WB结果灰度分析（±s）Tab 4 Analysis of GnRH and CaM proteins in hypothalamic arcaate nucleus of rats in each group by WB（±s）

表4 各组大鼠下丘脑弓状核GnRH、CaM 蛋白的WB结果灰度分析（±s）Tab 4 Analysis of GnRH and CaM proteins in hypothalamic arcaate nucleus of rats in each group by WB（±s）

注：与NG 组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；
与MG 组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

CaM 1.00±0.000 2.65±0.043**1.35±0.009▲▲**1.69±0.011▲▲**2.62±0.042**2.23±0.033▲▲**1.07±0.006▲▲**104.578组 别NG MG WH WM WL TMC WMCFn9 1 0 8 8 8 1 0 10 GnRH 1.00±0.000 1.94±0.026**1.14±0.018▲▲**1.32±0.024▲▲**1.63±0.033▲▲**1.38±0.031▲▲**1.03±0.019▲▲*89.553

绝经是女性必然经历的过程，由于机体激素水平及神经递质的变化可引发一系列临床症状，其中以血管舒缩及精神神经症状早发高发，重者可诱发焦虑抑郁等心理问题［10，11］，所以对MPS 的防治尤为关键。中医中药治疗MPS 疗效好、副作用小，一直备受患者青睐［12］。

MPS 属中医学“经断前后诸症”范畴［13］，既往也将其按照兼症不同，归属于中医学“脏躁”、“心悸”、“失眠”、“百合病”等疾病中。本病病机主要责之于肾，肾气亏虚、肾阴不足乃本病发病根本。乙癸同源，由于肾阴渐衰，终致水不涵木，伤津耗血，影响肝肾之阴。王孝莹教授认为机体阴阳失衡后出现的种种症状可按“妇人血劳”论治，并以油煎散主之［14］。原方主治妇人气短困倦、烘热汗出、困倦乏力等血风劳症状。王师在原方基础上加味，增入滋补肝肾、养血安神之品，成方五加丹方，临床应用30年，效果显著。

MPS 所表现出诸如血管舒缩、精神神经症状、睡眠障碍等等，并非单一由于体内雌激素水平的下降所引起，而是由于机体多种神经递质的改变所共同参与［15］。Kisspeptin 由下丘脑Kiss-1 基因所编码，可以作用于下丘脑促性腺激素释放激素GnRH 神经元的上游，与GnRH 相应受体GPR54 结合后刺激GnRH 的释放，从而导致生殖轴一系列激素水平变化［16］，与生殖功能等密切相关。本研究前期报道，去卵巢模型大鼠下丘脑Kiss-1、GPR54、GnRH mRNA 表达升高，五加丹方治疗组有效降低其表达，推测五加丹方下调GnRH mRNA 的表达是通过下调Kiss-1、GPR54mRNA 的表达所完成的。而Kisspeptin 通过与其受体GPR54 相结合，而后再与Gq/11α 蛋 白 结 合。PLC-β 及IP3 依 次 释 放，IP3 与IP3 受体（IP3R）结合后启动细胞内Ca2+信号系统，再 通 过CaM 等 促 进GnRH 的 释 放［6］。本 研 究 即 在前期研究基础上，通过Kiss-1 细胞内因子的转导以探讨五加丹方对GnRH 因子的影响。

实验结果显示，与NG 组相比，MG 组PLC-β1、IP3、IP3R、CaM 水平明显升高；
PLC-β1、IP3R1、Gn-RHmRNA 的表达也显著升高；
GnRH、CaM 蛋白的表达显著升高。前期有关五加丹方的实验研究证实，五加丹方可明显降低去卵巢模型大鼠血清FSH水平，其中WH 组还可使雌性大鼠去势后血清中升高的LH 水平降低；
WH、WM 组可使去势后雌性大鼠血清中降低的E2的水平升高。与MG 组比较，WH 组、WM 组 下 丘 脑 组 织 中Kiss-1、GPR54 mRNA 表达显著降低（P＜0.05），WH 组中GnRH mRNA 水平表达显著降低（P＜0.01）［17］。可见去势后大鼠下丘脑GnRH 水平的升高与Kiss-1/GPR54通路中相关因子的变化趋势成正相关，并且与IP3/CaM 系统中的两种因子表达的趋势也相同。Kiss-1同GPR54 结合以后，最终使GnRH 受到激活。去势大鼠血清FSH 以及LH 水平升高，促性腺激素的分泌可反馈调节使下丘脑Kiss-1/GPR54 系统中两因子表达升高。经五加丹方作用后，PLC-β/IP3/CaM通路中相关基因的表达均下调，下丘脑组织中PLC-β1、IP3、IP3R 以 及CaM 的 水 平 均 有 所 降 低，PLC-β1、IP3R1 mRNA 的表达也有所降低，CaM 蛋白的表达下降，从而GnRH mRNA 和蛋白表达也下调，促性腺激素FSH 和LH 水平降低，而后两者的升高与MPS 诸多症状相关［6］。

人体代谢功能与信号转导密切相关，几乎所有疾病的发生发展都与信号转导过度或减弱、中断有关［18］。对于五加丹方作用于绝经期性腺和中枢各环节的分子机制仍有待于进一步深入研究。

作者贡献度说明：

赵铭宇：实验设计，数据统计，撰写论文；
吕波：实验造模，药物干预及取材；
李灼：指标检测；
潘海云：文献查阅；
刘桂兰：实验数据审核，审阅。

所有作者声明无利益冲突关系。