人血清中福氏2a及宋内志贺菌O-特异性多糖抗体IgG含量间接ELISA定量检测方法的验证及应用

李红，石刚，郭丽娜，陈琼，付宏斌，王国东，胡小华，朱卫华，王斌，叶强

1.中国食品药品检定研究院卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室，北京 102629；
2.北京智飞绿竹生物制药有限公司，北京 100176

志贺菌属（Shigella）是引发细菌性痢疾的主要致病菌［1］，可分为4 个血清群（serotype），包括A 群痢疾志贺菌、B 群福氏志贺菌、C 群鲍氏志贺菌和D 群宋内志贺菌［2-6］。福氏志贺菌在发展中国家呈地方性流行，也是全球最常见的分离株，包括2a、3a、5b等16个亚型［3］，其中2a型是我国流行的主要型别［7］。在美国和其他高度工业化国家，宋内志贺菌是优势菌株［8-9］。我国痢疾发病率较高［7，10-12］，尤其在出现抗生素耐药株后，其发病率位居39种传染病前5位［13-16］。

痢疾疫苗的研究和使用可追溯至1903 年，但目前仍无理想的痢疾疫苗上市［17-18］。O-特异性多糖链（O-specific polysaccharide chain）简称O抗原，是志贺菌重要的保护性抗原之一，目前研究较多的是用生化方法提取O 抗原后与蛋白载体结合，制成多糖-蛋白结合疫苗［19-20］，接种人体后可产生特异性IgG，对志贺菌引起的疾病具有保护作用。检测人血清中IgG抗体的含量是评价该疫苗免疫应答水平的重要手段。本研究按照间接ELISA 法的建立及验证要求，对企业提供方法的准确性、精密性及特异性等方面进行验证［21-22］，并进行初步应用。

1.1 多糖及血清 福氏2a 及宋内志贺菌O-特异性多糖（分别简称福氏2a 多糖及宋内多糖）、参考血清（血清08，赋值为100 EU／mL）、质控血清（血清96）及福氏宋内痢疾双价疫苗免疫前后1 842 份人血清样本均由北京智飞绿竹生物制药有限公司提供。

1.2 主要试剂 碱性磷酸酶标记羊抗人IgG（货号：A3187）及磷酸-4-硝基苯酯二钠盐（4-Nitrophenyl phosphatedisodium salthexahydratepNPPdisodium salthexahydrate，PNPP）（货号：P4744）均购自美国Sigma-aldrich公司；
牛血清白蛋白购自德国默克公司；
PBST 购自北京万泰生物药业有限公司。

1.3 检测方法 将福氏2a及宋内多糖分别按10 μg／mL浓度包被96 孔板，100 μL／孔，4 ℃包被过夜；
洗液（含0.05%吐温的生理盐水）洗涤2 次，用含4%牛血清白蛋白的PBST 于37 ℃封闭1 ～2 h；
加入待测血清（1∶10稀释），100 μL／孔，37 ℃作用2 h；
洗液洗涤3次，加入碱性磷酸酶标记羊抗人IgG（1∶40 000 稀释），100 μL／孔，37 ℃孵育2 h；
洗液洗涤3 次，加入PNPP 溶液，100 μL／孔，37 ℃孵育2 h；
用3 mol／L氢氧化钠终止反应，用酶标仪检测A405及A690。采用四参数法绘制参考血清的标准曲线，计算每份血清福氏2a和宋内多糖抗体IgG含量。

1.4 方法的验证

1.4.1 准确性 将参考血清及质控血清按一定比例混合（见表1），制备成10 份不同浓度的血清样本，编号为S1 ～S10，按1.3 项方法连续检测6 d，并按下式计算抗体回收率。

表1 参考血清与质控血清的混合比例（%）Tab.1 Mixing ratio of reference serum and quality control serum（%）

1.4.2 精密性

1.4.2.1 试验内精密性 将1.4.1 项中制备的血清样本S10 及QC 按1.3 项方法连续检测6 d，每天重复检测3次，计算每天每份样本3次检测结果的CV。

1.4.2.2 试验间精密性 将1.4.1 项中制备的S1 ～S10 血清样本及质控血清（编号为QC）按1.3 项方法连续检测6 d，计算每份样本6 次检测结果的变异系数（coefficient of variation，CV）。

1.4.3 特异性 将福氏2a 及宋内多糖分别稀释至400 μg／mL，等体积分数混合后，再与参考血清（1∶100 稀释）按等体积分数混合，置37 ℃孵育2 h，以该血清作为阴性血清。将福氏2a和宋内多糖分别稀释至200、100、40、10、4、1、0.4、0.2、0.1、0.04、0.02、0.01、0.005、0.001、0.000 1、0 μg／mL，分别与参考血清及阴性血清（均1∶100 稀释）按等体积分数混合，将混合血清置37 ℃孵育2 h，酶标仪检测A405，并按下式计算抑制率。以多糖浓度的对数值为横坐标，抑制率为纵坐标，绘制抑制曲线。

1.4.4 线性范围 按1.3 项方法检测参考血清，以抗体含量为横坐标，A405为纵坐标，绘制标准曲线，获得曲线方程，计算相关系数（R2）。

1.4.5 定量限（limit of quantitation，LOQ） 将1.4.1项中制备的S1 ～S10 血清样本按1.3 项方法连续检测6 d，计算多糖抗体IgG 回收率及其CV，回收率计算公式同1.4.1 项。以回收率CV低于20%的相应参考血清含量作为方法的LOQ。

1.5 方法的应用 采用验证的方法检测福氏宋内痢疾双价疫苗免疫前后的1 842份血清样本。

1.6 数据整理与分析 应用SoftmaxPro 5.4.1软件进行整理数据及作图。

2.1 方法的验证

2.1.1 准确性 10 份血清样本中福氏2a 多糖抗体IgG含量为97.10～109.82EU／mL，回收率为73.21%～222.68%，除S1外均在60%～140%范围内；
宋内多糖抗体IgG 含量为32.07 ～62.17 EU／mL，回收率为83.67%～123.56%，均在60%～140%范围内。见表2。表明该方法具有良好的准确性。

表2 准确性验证结果（n=6）Tab.2 Verification for accuracy（n=6）

2.1.2 精密性

2.1.2.1 试验内精密性 连续6 d，每天3次检测10份血清样本，福氏2a多糖抗体IgG含量的CV为0.06%～9.92%，宋内多糖抗体IgG 含 量 的CV为0.63% ～3.91%，均＜30%，见表3。表明该方法具有良好的试验内精密性。

表3 试验内精密性验证结果（n=3）Tab.3 Verification for precision within tests（n=3）

2.1.2.2 试验间精密性 连续6 d 检测10 份血清样本福氏2a多糖抗体IgG含量的CV为3.09%～9.10%，宋内多糖抗体IgG 含量的CV为3.85% ～11.88%，均＜30%，见表4。表明该方法具有良好的试验间精密性。

表4 试验间精密性验证结果（n=6）Tab.4 Verification for precision between tests（n=6）

2.1.3 特异性 随着吸收多糖浓度的增高，参考血清的抑制率增加，阴性血清增加不明显。福氏2a多糖吸收浓度达100 μg／mL时，参考血清抑制率达85.95%，阴性血清抑制率为2.89%；
福氏2a多糖吸收浓度为5×10-5μg／mL时，参考血清抑制率达-0.61%，阴性血清抑制率为14.97%。宋内多糖吸收浓度达100 μg／mL时，参考血清抑制率达88.42%，阴性血清抑制率为1.65%；
宋内多糖吸收浓度达5 × 10-5μg／mL 时，参考血清抑制率达1.04%，阴性血清抑制率为6.71%。见图1。表明两种多糖与血清可发生特异性反应。

图1 多糖抗原对血清抗体的抑制曲线Fig.1 Inhibition curve of polysaccharide antigen on serum antibody

2.1.4 线性范围 两种多糖抗体IgG含量间接ELISA检测标准曲线见图2。福氏2a 多糖抗体IgG 含量在0.05 ～0.125 EU／mL 范围内，与A405呈良好的线性关系，线性方程为Y=（-0.032 3-9.97）／［1+（X／0.501）0.822］+9.97，R2≥0.99；
宋内多糖抗体IgG含量在0.025 ～0.125 EU／mL 范围内，与A405呈良好的线性关系，线性方程为Y=（-0.005 51-4.79）／［1+（X／0.078 2）0.978］+4.79，R2≥0.99。

图2 血清多糖抗体含量间接ELISA检测标准曲线Fig.2 Standard curve of indirect ELISA for detection of serum polysaccharide antibody content

2.1.5 LOQ 福氏2a和宋内多糖抗体IgG检测的LOQ分别为0.05和0.025 EU／mL。见表5。

表5 福氏2a及宋内多糖抗体IgG含量检测IOQ的确定（%）Tab.5 LOQ for detection of IgG content of flexneri 2a and sonnei polysaccharide antibody（%）

2.2 方法的应用 福氏宋内痢疾双价疫苗免疫前血清样本中，福氏2a多糖抗体IgG含量为0.18～0.48EU／nL，宋内多糖抗体IgG 含量为0.08～0.43 EU／mL；
免疫后血清样本中福氏2a多糖抗体IgG 含量为2.59～17.03 EU／mL，宋内多糖抗体IgG 含量为5.38～16.64 EU／mL。免疫后血清中抗体IgG 含量大幅高于免疫前。

目前，评估痢疾疫苗临床效果的主要检测手段为ELISA 法检测血清中的抗体滴度，该方法由北京智飞绿竹生物制药有限公司建立，于中国食品药品检定研究院细菌多糖和结合疫苗室进行了准确性、精密性和特异性等方面验证。定量限验证结果显示，S1 ～S10 血清样本中S1、S2、S3 及S7 的福氏2a 多糖抗体IgG 回收率CV均＞20%，以S2 为例，6 次测定的平均回收率为73.21%，但回收率CV为96.56%，表明此时无法稳定检测出S2 血清内参考血清的抗体IgG含量，即该浓度抗体无法准确定量；
当回收率CV较低时，该血清内所含参考血清的抗体才可准确定量［7］。因此，以回收率CV低于20%的参考血清抗体含量作为该方法的定量限，福氏2a 和宋内多糖抗体IgG 检测的定量限分别为0.05 和0.025 EU／mL。在福氏2a 的回收率均值中，S7 的回收率CV大于20%，初步分析应为偶然误差，今后将通过增加检测次数来验证该结果的准确性。

准确性验证结果显示,福氏2a 和宋内多糖血清IgG 回收率分别为90.58% ～132.43%和83.67% ～106.13%，表明方法准确性较高；
精密性验证结果显示，试验间CV分别为3.09% ～9.10%和3.85% ～11.88%，试验内CV分别为0.06%～9.92%和0.63%～3.91%，表明方法具有良好的精密性；
特异性验证结果显示，在竞争抑制ELISA 中，随着多糖吸收浓度的增高，参考血清对福氏2a多糖的抑制率从-0.61%升至85.95%，对宋内多糖的抑制率从1.04% 升至88.42%，表明两种多糖与血清可发生特异性反应。综上所述，该方法可满足痢疾疫苗临床血清抗体定量检测的要求。

目前，国内外的痢疾疫苗临床血清免疫原性检测中，仍以半定量法为主，即用血清抗体水平滴度表示［23-25］，无法准确检测出血清的抗体水平，急需建立定量检测方法，才能更准确描述机体的免疫水平和免疫状态。本研究检测中所用的参考血清抗体值仍采用赋值的方式，对于定量检测方法仍是一个缺陷，但国际尚无已定值的参考血清，需采用其他方法来进行参考血清抗体值的首次定量，这也是今后的研究需要解决的问题。