大花红景天总酚提取工艺优化及抗氧化活性研究

孙羽珂 谢叶林 唐小慧 赵文吉 何正军 贾国夫 黎 剑 陈宇航

1.成都医学院药学院，四川成都 610500；
2.四川省草原科学研究院青藏高原高寒草地生态修复工程技术研究中心，四川成都 611731；
3.四川省农业科学院农产品加工研究所，四川成都 610066

大花红景天[Rhodiola crenulata（HooK.f.et.Thoms）H.Ohba] 为景天科红景天属多年生草本或灌木植物，以其干燥根和根茎入药，为《中华人民共和国药典》[1]（2020 版）红景天药材的基原植物，主产于西藏、四川等地。主要成分有黄酮类、萜类、酚类、有机酸类等[2]，大花红景天在抗肿瘤、保护心血管系统、抗疲劳、抗氧化、保肝[3-4]等方面具有药理活性。大花红景天富含总酚类成分，在抗感染、抗癌和保护心脑血管[5-8]等方面效果明显；
其还可通过调节抗氧化系统、能量代谢系统、中枢系统[7-9]等多方面发挥抗疲劳作用。

近年来，大花红景天需求量日益增加，因其生长在海拔高度2 300～5 000 m 的地区，环境较为恶劣，导致野生资源量正在急剧减少，部分地区濒临灭绝[10]；
同时人工栽培面积较少，栽培技术不完善，缺乏对适宜采收期的确定，进一步加剧大花红景天资源的匮乏。故本研究利用响应面法优化大花红景天总酚提取的工艺条件，构建超声波辅助提取大花红景天总酚的最优工艺，使优化后的提取工艺具备经济、工艺稳定和提取率高等优势。在此基础上，通过分析野生与栽培大花红景天药材总酚含量与体外抗氧化活性及其相关性，为栽培大花红景天采收期确定提供科学依据。

1.1 药材

大花红景天，野生及栽培样品来源见表1，样品去除泥土等杂质，60℃烘干至恒重，打粉备用，供试样品经四川省草原科学研究院贾国夫研究员鉴定为景天科大花红景天[Rhodiola crenulata（HooK.f.et.Thoms）H.Ohba]根及根茎。见表1。

表1 样品来源

1.2 仪器和试剂

KH2200DB 型数控超声波清洗器（昆山禾创超声仪有限公司）；
FA1204 万分之一电子天平（上海皓庄仪器有限公司）；
A590 型紫外分光光度计（翱艺仪器有限公司）；
GF02100g 多功能粉碎机（上海霸辉工具有限公司）。

没食子酸标准品（纯度＞98%，批号：M01711812016，成都瑞芬思生物科技有限公司）；
福林酚（北京索莱宝科技有限公司，批号：NO.921O039）；
2，2-联苯基-1-苦基肼基（上海麦克林生化科技股份有限公司，批号：C11629788）；
2，2-联氨-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（上海麦克林生化科技股份有限公司，批号：C11899818）。水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2.1 标准曲线制作

精密称取没食子酸对照品5.15 mg，加蒸馏水得浓度为0.103 mg/ml 对照品溶液。精密吸取没食子酸对照品溶液0.0、0.1、0.3、0.5、0.6、0.8 ml 于10 ml 容量瓶中，加福林酚试剂0.5 ml 及20%碳酸钠溶液1.7 ml，加蒸馏水定容。避光放置30 min，在760 nm 波长处测定吸光度，回归方程Y=10.605X+0.0733，r＝0.9995，Y 为吸光度，X 为对照品浓度，线性范围0.00～0.08 mg/ml。

2.2 供试品溶液制备及测定

精密称取大花红景天药材粉末（HY2）0.1 g，加入一定量乙醇溶液在设定条件下进行超声辅助提取。精密移取100 μl 样品提取液于10 ml 容量瓶中，按照“1.2.1”的方法测定提取液吸光度：

2.3 响应面优化试验

2.3.1 响应面试验设计及结果 根据单因素预试验结果，选用乙醇浓度、提取时间、提取温度为变量因素，进行三因素三水平试验设计，见表2。前期试验证实料液比固定选用0.1∶8.0 g/ml，以总酚含量为响应值，其中乙醇浓度选用50%为佳、提取时间选用40 min 为佳、提取温度选用50℃为佳。具体试验结果见表3。

表2 试验设计因素和水平

表3 响应面分析设计及结果

2.3.2 响应面方差分析及结果 对数据进行二次多元回归拟合，建立二次多元回归方程：Y=12.16+0.46A+0.24B+0.23C-0.8AB+0.074AC+0.74BC-0.75A2-1.64B2-1.31C2。R2=0.982 8，调整后的R2=0.960 7，预测的R2=0.768 0，变异系数为2.65，精确度为18.391。三种水平因素对大花红景天总酚含量提取率影响程度排序为：乙醇浓度＞提取时间＞提取温度。一次项A，二次项A2、B2、C2，交互项AB、BC 对总酚含量提取率达到显著水平（P＜0.01）。见表4。响应面AB、BC 交互面坡度陡、等高线密集，提示这两种因素对响应值的影响显著，见图1。

图1 各因素交互作用对总酚含量的影响

表4 响应面回归模型方差分析及结果

2.3.3 验证实验 通过Design Expert 8.0.6 软件预测最佳提取工艺为：乙醇浓度为53%、提取时间为40 min、提取温度为51℃，预测总酚提取率为12.24 mg/g。结合实际修正条件：乙醇浓度为50%、提取时间为40min、提取温度为50℃。利用此条件进行3 次提取试验，总酚提取率为（12.22±0.05）mg/g。

2.4 抗氧化活性研究

2.4.1 总酚含量测定 以优化后的最佳提取工艺得到大花红景天提取液，计算总酚含量，栽培2 年生大花红景天药材7—9 月进行总酚含量测定，9 月20 日达到最高值，为7.36 mg/g。野生药材总酚含量均显著高于人工栽培2 年生药材，以采自小金县野生样品（HY2）总酚含量最高，为14.68 mg/g，见表5。

表5 不同采收期大花红景天总酚含量及抗氧化活性研究（n=3）

表6 不同来源大花红景天提取液总酚含量及体外抗氧化能力比较

2.4.2 自由基清除率测定 取4 ml DPPH·溶液，加入1 ml无水乙醇，于517 nm 处测定吸光度A0。取1 ml 不同浓度提取液于4 ml 的DPPH·溶液中，摇匀后室温避光放置30 min，在517 nm 处测定吸光度A1。用无水乙醇替换DPPH·溶液，测定其吸光度为A2。

取3 ml ABTS+·溶液，加入1 ml 蒸馏水，于734 nm波长处测定吸光度A0。取1 ml 大花红景天不同浓度提取液于3 ml ABTS+·溶液，摇匀后室温静置10 min。在734 nm 处测定吸光度A1。用蒸馏水替换ABTS 溶液，测定其吸光度为A2。

将清除率（%）导入GraphPad Prism 8 统计软件中，以半数抑制浓度（median inhibitory concentration，IC50）值（mg/ml）表示清除能力，该值越小，抗氧化剂清除能力越强[11-12]。

野生样品抗氧化活性强于人工栽培2 年生样品，大花红景天提取液清除DPPH·能力强于清除ABTS+·。见表5～6。

2.4.3 相关性分析

通过软件IBM SPSS Statistics 26.0 处理数据可知，总酚含量与IC50值呈显著负相关。见表7。

表7 总酚含量与体外抗氧化活性的相关性分析（r 值）

总酚提取含量受乙醇浓度、时间、温度等因素影响[13-15]。本研究通过响应面试验，得到最优提取条件：乙醇浓度为50%、提取时间为40 min、提取温度为50℃，大花红景天总酚提取率为12.22 mg/g。红景天活性成分含量与其生长的土壤、施肥量、光照、气温等环境条件有关[16]。本研究结果显示，栽培2 年生大花红景天9 月20 日其总酚含量达到最大值；
同时，有研究表明，秋季采挖红景天总酚含量高[17]，人工驯化样品10 月最高[18-19]，因此，大花红景天适宜采收期为9 月下旬至10 月下旬地上部分枯萎后。

野生大花红景天总酚含量均显著高于人工栽培品，可能原因是生长年限将影响有效物质积累[20]；
栽培样品仅为2 年生，而野生为多年生，同时栽培样品的生长环境与野生环境不一致，酚类物质为主要次生代谢产物，其植物应对逆境胁迫过程起到保护和调节作用，有利于群落延续[21-22]。

本研究显示，大花红景天总酚具有较强体外抗氧化活性，野生样品总酚含量和抗氧化活性均优于人工栽培样品，大花红景天总酚含量随不同采收期而变化，其不同采收期总酚类物质含量变化趋势与不同采收期清除自由基能力变化趋势一致[23]。总酚含量与抗氧化活性具有显著的正相关性[24-25]，本研究结果为大花红景天栽培和资源开发利用提供参考。